microRNA表达检测技术进展

　　作者：张宇,张勇,杨长成,王振宁　　作者单位：1.中国医科大学附属第一医院肿瘤外科，辽宁 沈阳 ;中国医科大学附属第一医院普通外科教研室胃肠肿瘤外科，辽宁 沈阳 ;　2.沈阳市肛肠医院肛门病科，辽宁 沈阳

　　【摘要】microRNA(miRNA)是一类新发现的非编码、内源性小RNA分子，通过与靶基因mRNA结合参与多种基因的表达调控。miRNA表达的检测技术主要以杂交和反转录聚合酶链反应(RTPCR)为主。近年来，这些技术不断得到改进,例如，RNA加尾和引物延伸在RTPCR技术中的应用，为深入研究miRNA功能提供了有力的工具。现对检测miRNA表达的相关技术进展加以综述。

　　【关键词】 miRNA;表达调控;检测技术

　　microRNA(miRNA)是一类非编码、内源性的小RNA，长约21～25核苷酸(nucleotides，nt)。经预测，人类基因组编码了超过1 000种不同的miRNA[1]。近年来国内外研究已经在动植物体内证实了数百种miRNA[2]，并确定了少数miRNA的功能，但大部分miRNA的功能尚不清楚[3]。解决这一问题的首要环节是找出各miRNA在组织或细胞中表达的组织和时序特异性。自1993年首次发现miRNA以来，检测其表达水平的技术方法迅速发展，虽然传统方法如Northern杂交技术等仍在miRNA表达检测中起着重要作用，但许多针对miRNA检测的新技术方法不断涌现，为深入研究miRNA提供了更多的帮助。在此，作者对传统及最新发展的miRNA表达检测方法作一简要综述，以期对miRNA研究提供一些思路和启发。

　　1 miRNA简介

　　1993年，Lee等[4]在对线虫的研究中发现了首个miRNAlin 4，当时有研究指出lin 4可以抑制lin14蛋白表达，但机制不清。直至2000年，发现第2个miRNAlet7[5]及其在人类和果蝇中同源体后，人们逐渐认识到miRNA是一类进化保守，在生物进化[6]和疾病发展过程中起着调控作用的重要分子，通过抑制靶基因的表达产生基因沉默效应[78]。越来越多的miRNA得到鉴定，目前估计人类miRNA总数在800种以上，是最初预测miRNA种类的3倍以上[9]。

　　miRNA生物合成是一个复杂的过程，首先在细胞核内由miRNA基因转录产生primiRNA，primiRNA经Drosha切割作用释放出长约70 nt的茎环结构—premiRNA[10];premiRNA转运至细胞质后经过酶的修饰作用形成成熟的miRNA。miRNA与RNase、解螺旋酶等活性分子构成RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex,RISC)。RISC通过特异地锚定在靶mRNA上介导目的mRNA的切割或翻译抑制，从而调控目的基因的表达。

　　2 miRNA检测技术

　　2.1 Northern杂交

　　Northern杂交是检测miRNA表达的一种简便而可靠方法[11]，不仅用于检测miRNA在组织细胞中的表达水平，而且结合RNA marker，可经凝胶电泳检测miRNA的分子大小。

　　1993年始，Northern杂交应用于miRNA表达谱研究，也是首个用于半定量检测miRNA的实验技术，通过将已知浓度梯度的寡核苷酸参照物与待测样品进行平行杂交，实现对miRNA的半定量检测[12]。而后，Northern杂交成为检测细胞中miRNA表达的常规研究方法之一。Hayashita等[13]用该技术比较正常细胞和肺癌细胞中的表达情况，发现miR1792在肺癌中的表达明显升高。Sempere等[11]用该技术检测了已知的119个miRNA表达谱，发现一部分在特异组织中表达,一部分无特异性，且在不同组织中表达水平各异。

　　Northern杂交最大的缺点是对样品的需求量较高，需要微克级样品才能避免假阴性，有时样品量达到40 μg才会出现明显杂交信号。

　　2.2 原位杂交

　　原位杂交分为细胞和组织内原位杂交，该技术检测miRNA表达，可更直观的展示出miRNA的时空表达模式。80年代后期可在福尔马林固定、石蜡包埋的组织中进行原位杂交，近年来扩展到细胞及亚细胞水平进行miRNA的检测[10]。该技术不仅可以检测不同细胞系单个细胞中的miRNA表达，还可在不经分类和分离的情况下，比较不同细胞系中miRNA的表达水平。Wienholds等[14]首次将LNA探针(locked nucleic acidmodified probe，LNA)用于原位杂交技术，检测了斑马鱼(Zebrafish)100余种miRNA的空间表达模式。他们用相同的技术观察了115种在脊椎动物中表达保守的miRNA表达谱，又用基因芯片技术检测了相同的miRNA在斑马鱼胚胎不同发育阶段的表达谱，并将二者加以对比。随后Kloosterman等[15]对该技术的重要参数进行优化，使之逐渐成为分析miRNA表达组织和时序特异性的有力工具。

　　2.3 基因芯片

　　基因芯片技术可以高通量的检测基因表达谱。最初的miRNA基因芯片，是将反义DNA探针点在尼龙膜上，然后以5′端放射性标记的miRNA样品杂交，再经放射自显影获得信号[16]。

　　至今，很多研究应用该技术建立了不同物种不同组织中miRNA的表达谱，亦有研究比较了正常组织和和疾病组织中miRNA表达谱的差异。Liu等[17]用芯片技术检测了miRNA在不同肿瘤细胞中的表达谱，均经Northern杂交、RTPCR证实。Calin等[18]用该技术比较了哺乳动物中B细胞淋巴瘤和正常组织中miRNA的表达谱，为miRNA在肿瘤临床诊治中的应用提出了新思路。Murakami等[19]用该技术比较肝癌组织和邻近非肿瘤组织miRNAs表达谱，发现miR18和miR224在肝癌组织中的表达明显上调，而miR199a、 miR195a、miR200a和miR125a在肝癌组织中的表达明显下降。在芯片的基础上，Nelson等[20]提出一种称为RAKE(RNAprimed,arraybased Klenow)的方法，在特定的细胞中同时检测所有miRNA的表达谱，并且能够检测出福尔马林固定、石蜡包埋组织中的miRNA表达谱，使分析保存标本中的miRNA表达谱成为可能。

　　尽管基因芯片技术敏感度有了很大提高，且可用于多个miRNA同时检测，但仍有不足：基因芯片的制作和检测需要昂贵的仪器设备;结果是半定量的，重复性较差;不能同时优化所有待测miRNA的杂交环境，因而不能区分高度类似的miRNA，等等。锁定的核苷酸修饰探针(locked nucleic acidmodified probe)[21]在基因芯片技术的应用，可能会进一步较精确地区分高同源性miRNA的表达差异。

　　2.4 反转录聚合酶链反应(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RTPCR)

　　2.4.1 半定量RTPCR

　　RTPCR作为半定量或定量检测miRNA表达的常用实验方法，在研究miRNA表达的过程中不断得到改进。半定量RTPCR是常用的一种简洁、快速、特异的相对定量的RNA检测技术，只能测定miRNA的相对含量，有研究用该技术成功对比了待测和对照样本之间特异miRNA的表达差异。Akao等[2223]用该技术研究发现，miR143、miR145和miRlet7在结肠癌组织中的表达水平明显低于相应的正常组织。后来有研究对半定量RTPCR加以改进:(1)RNA加尾RTPCR：RNA加尾RTPCR是在传统RTPCR的基础上发展而来，可用于半定量或定量检测miRNA的表达,结果与Northern杂交一致。该技术有以下优点：可在较短时间内获得结果;高通量，可同时检测多种miRNA的表达;与Northern杂交相比，仅需少量RNA，且不用放射性同位素标记;可同时检测到成熟miRNA及其对应的premiRNA;操作过程简单。该技术检测miRNA表达时需注意以下问题：有的miRNA和其他miRNA具有同源区域，它们的引物序列就是miRNA基因序列5′端的一部分，因而要确保引物3′端的不同;退火温度是保证高度特异扩增的关键因素，有研究提出，较高的退火温度(60 ℃～61 ℃)可提高反应的特异性[24];与用总RNA相比，使用从低分子量RNA中富集的miRNA可提高该技术的敏感性。Fu等[24]用该技术检测了miR19b、miR27a等miRNA，结果与northernblot杂交一致。(2)引物延伸RTPCR：引物延伸RTPCR既可检测成熟的miRNA，也可检测单个miRNA和siRNA。Zeng等[25]通过引物延伸并用放射性带移法(radioactive bandshift assay)检测了成熟miR30、miR21的表达水平。后经改进把引物延伸用于实时RTPCR 定量检测miRNA的表达，包括以下步骤：用加尾的特异引物把miRNA反转录为cDNA，在cDNA的一端引入1个结合位点延长长度;实时定量PCR检测。

　　2.4.2 实时定量RTPCR

　　实时定量RTPCR可用于检测miRNA在肿瘤中的表达水平。Schmittgen等[26]用实时定量RTPCR成功检测到23种miRNA前体在人类6种不同癌细胞系中的表达水平。2005年，Jiang等[27]用该技术检测222种miRNA在不同肿瘤细胞系中的表达情况，发现在一些肿瘤中确有特异性的miRNA存在。Lee等[28]用同样的方法发现miR221、miR376和miR301在胰腺癌中显著高表达。但是传统实时定量RTPCR只能检测到miRNA前体，为了解决这一问题，后来的研究者提出了Steploop实时定量RTPCR技术。

　　Steploop实时定量RTPCR是一项高特异度、敏感度的检测miRNA表达的实验技术，包括设计具有茎环(stemloop)结构的反转录引物和用miRNA荧光标记的特异分子探针进行实时PCR 2个关键步骤[29]。该技术有以下优点：高度特异性，特异的Steploop 反转录引物和探针确保反应不受其前体及基因组DNA污染等因素的干扰，对序列高度同源的miRNA也可精确区分;超宽的定量线性范围和高度的检测灵敏度，从几个拷贝到几万个拷贝，定量线性范围跨越7个数量级;样品消耗少，仅需1～10 ng的总RNA;适用范围广，总RNA 、细胞裂解物以及纯化的RNA都可用于miRNA的定量检测，也可用于其他小分子RNA的检测，如siRNA。但是该技术需要较昂贵的实验材料及仪器。Zhang等[29]用该技术检测32例胃癌标本中miRlet7a的表达水平，发现其在14例的癌组织中比相应正常组织的表达水平明显降低。Chen等[30]亦用同样的方法比较了5种miRNA在小鼠7种不同组织的表达差异。

　　Shi等[31]把RNA加尾和引物延伸用于实时定量RTPCR，成功检测了植物中miRNA表达。张旗等[32]用同样的方法对15种miRNA在大鼠心、肝和大脑皮层的表达进行检测，验证了该技术的可靠性。

　　3 结语

　　miRNA的发现是中心法则中RNA次要中介作用的重要补充，将促使生物学家们重新思考细胞遗传调控及其发育等方面的重要问题。目前，对miRNA的研究取得突破性进展，但仍有大量问题亟需解决，首要问题是检测miRNA表达水平及鉴定它们的靶基因。miRNA检测技术经历了从相对定量到定量，从低敏感度、特异度到较高敏感度、特异度的发展过程，有了很大的改进，但都存在有待完善之处。相信随着检测技术的进一步改进，对miRNA的研究也会不断取得进展。

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