替尼泊甙对胃癌细胞凋亡及细胞周期的影响

　　作者：罗执芬,周云,刘明月　　作者单位：郑州，河南省人民医院肿瘤科

　　【摘要】 目的探讨替尼泊甙体外对胃癌细胞BGC823的作用机制。方法体外培养胃癌细胞株BGC823，通过MTT法，流式细胞仪，观察替尼泊甙对胃癌细胞的生长抑制作用以及对细胞凋亡，细胞周期的影响。结果在一定浓度范围内，细胞的生长抑制率随着浓度的增加而增加，细胞的凋亡率随着时间的增加而增加，细胞周期被阻滞在G2/M期，在48小时达到高峰。结论替尼泊甙可抑制胃癌细胞的生长，诱导细胞的凋亡，其诱导凋亡的能力可能是通过把细胞阻滞在G2/M期实现的。

　　【关键词】 替尼泊甙;胃癌;凋亡;细胞周期

　　Effects of Teniposide on Cell Cycle Phase and Apoptosis of Gastric Carcinoma Cell Lines

　　LUO Zhifen, ZHOU Yun, LIU Mingyue

　　Department of Oncology, Henan Provincial People's Hospital, Zhengzhou 450003, China

　　Abstract：Objective To identify the action mechanism of teniposide on gastric carcinoma cell line BGC823. MethodsThe suppressive rate of cell growth of teniposide was examined by MTT assay, the development of cell cycle and apoptosis induced by teniposide was examined by flow cytometry.ResultsMTT assay showed that various concentration of VM26 could effetely inhibit the growth cell; according to the results of flow cytometry, some typical sub diploid peaks were observed,the distribution of cell cycle phase changed at various time, the cell cycle of G2/M phase was arrested within 48 hours. ConclusionVM26 could significantly inhibit the growth and proliferation of gastric carcinoma cell lines in vitro. Apoptosis induced by VM26 was the major mechanisms of VM26. The influence of the distribution of cell cycle phase was associated with apoptosis.

　　Key words：Teniposide; Gastric carcinoma; Apoptosis; Cell cycle phase

　　0引言

　　基础研究表明，替尼泊甙(VM26)对细胞DNA的作用是同类药物依托泊甙(VP16)的8~10倍，但VM26在消化系统肿瘤的治疗上应用较少，本实验通过多种实验方法，观察了VM26对胃癌细胞的体外抗瘤活性和诱导细胞凋亡的能力，探讨其在胃肠肿瘤上应用价值。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1细胞株人胃癌细胞BGC823，河南省医学研究所惠赠。

　　1.1.2药物及试剂替尼泊甙为美国百时美施贵宝公司产品(批号：6G14423)，1640 培养基(GIBCO公司产品)，标准胎牛血清(天津TBD血液研究所产品)，鼠抗人p53单克隆抗体(迈新试剂公司)， 即用型SP免疫组化试剂盒和浓缩型DAB显色试剂盒为美国Sigma公司产品。

　　1.2方法

　　1.2.1细胞形态学观察倒置显微镜下观察不同时间段的细胞生长情况。并取不同时间段的细胞涂片固定，免疫组化染色，观察细胞凋亡相关蛋白p53表达变化。

　　1.2.2MTT法测定不同浓度下细胞生长抑制率的变化取对数生长期的细胞，接种于96孔板，孵育48h后，酶联免疫检测仪在570nm波长测每孔的吸光值(OD)、按下列公式计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率(%)=(1实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。每组重复5次。

　　1.2.3细胞凋亡率和细胞周期检测本次仅选较小的药物浓度组作流式细胞仪检测，每浓度取4个时间段，即药物作用后0、12、24、48h。按实验设计处理细胞，处理完毕后，用70%的冷乙醇固定。采用碘化丙锭(PI)一步插入性DNA定量荧光染色法，检测细胞周期和细胞凋亡率。

　　1.3统计学处理实验数据采用SSPS10.0统计软件包处理，计量资料采用正态性检验，方差齐性检验，均数间的两两比较采用LSD方法;率的比较采用χ2检验，单样本t检验，以α=0.05为检验水准。

　　2结果

　　2.1VM26作用后对细胞生长的形态变化对照组12h后，细胞呈贴壁生长，呈长梭形或多角形，排列整齐。24h后，细胞生长状态良好，占瓶壁的60%;48h后，仍呈贴壁生长，分布整齐，占据瓶壁的80%面积，见图1。实验组12h细胞大部分呈贴壁生长，部分胞体变圆、变小，折光性增强，高倍镜下可见胞浆内有较多的粗大颗粒。24h细胞大部分变圆，胞体变小，部分边界不清，胞浆内颗粒粗大，部分细胞崩解，碎裂。少部分细胞呈贴壁生长。48h细胞大部分崩解死亡，悬浮与培养液中，少数的细胞仍贴壁生长。

　　2.2细胞凋亡相关蛋白p53表达的影响结果显示，凋亡相关基因p53的蛋白阳性表达产物位于细胞的细胞核内，呈棕色颗粒。VM26作用48h后，实验组p53的蛋白表达的阳性率(0.7260±0.067)明显高于对照组(0.5035±0.017)，两者之间的差异有统计学意义(P=0.024)。

　　2.3VM26作用后细胞生长抑制率的变化在一定浓度范围内，细胞生长抑制率随着浓度的增加而逐渐增加。

　　2.4VM26作用后细胞周期分布VM26处理细胞后，细胞周期分布图上出现典型的亚二倍体凋亡峰。随着作用时间的延长，凋亡峰逐渐增高。

　　2.5VM26对细胞周期和凋亡率的影响随时间的延长，G2/M细胞逐渐增加，48h达到最高，与0h相比差异有统计学意义(P=0.000)。G1/G0期、S期的细胞变化也有差异，在48h时表现出G1/G0期、S期的显著减少。细胞的凋亡率也随时间的延长而增加。24、48h细胞的凋亡率与0h比较，差异有统计学意义(P=0.000)，12h的凋亡率与0h比较，差异无统计学意义(P=0.119)。

　　3讨论

　　本实验结果显示在不同浓度的VM26作用下，细胞生长抑制率随着浓度的增加而增加。随着时间的延长，G2/M期的细胞显著增多，表现出G2/M期的强力阻断作用，细胞凋亡率也逐渐增多，提示这与Li等[1]在口腔肿瘤中的实验结果相一致。90年代初人们发现不同因素诱导的凋亡，发生在细胞的不同周期。这类细胞的凋亡往往是细胞先被阻止在细胞周期的某一时段，然后发生凋亡[2]。p53是细胞生长周期中负调节因子。在DNA复制损伤时，p53上调p21的表达，导致G1期阻滞，使细胞在进入S期前修复损伤DNA或凋亡[3]。本实验结果显示，VM26作用后p53的蛋白表达较对照组明显增加(P<0.05)，细胞的凋亡率增加，但细胞没有阻滞在G1期，而是表现出强大G2期阻断。这与VM26在乳腺癌中的实验结果相一致[4]。说明p53的上调不是仅能导致G1期阻滞，而是根据细胞发生损伤的周期时段不同而把细胞阻滞在不同的周期。Bunz等[5]的研究也表明p53和p21使DNA损伤的细胞阻滞在G2期也是必需的。本实验药物VM26对胃癌细胞有良好的抗肿瘤作用，其诱导的凋亡可能是通过G2/M期的阻止来实现的。

　　【参考文献】

　　[1]Li J,Chen W,Zhang P,et al.Topoisomerasae Ⅱ Trapping agent teniposide induces apoptosis and G2/M or S phase arrest of oral squamouse cell carcinoma[J]. World J Surg Oncol, 2006, 6(4):41.

　　[2]Gong J，Li x，Traganos F，et al. Different patters of apoptosis of HL60 cells induced by cycloheximide and camptothecin[J]. J Cell physiol，1993(2),157:263270.

　　[3]Sheikh MS,Chen YQ,Smith ML,et al.Role of p21WAF1/CIP1/Sdi1 in cell death and DNA repair as studied using a tetracyclineinducible in p53deficient cells. Oncogene[J], 1997,14(15): 18751882.

　　[4]Magnet KJ, Orr MS, Cleveland JL, et al. Suppression of cmyc expression and cMyc function in response to sustained DNA damage in MCF7 breast tumor cells[J]. Biochem Pharmacol. 2001,62(5):593602.

　　[5]Bunz F, Dutriaux A, Lenganer C, et al. Reguirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage[J]. Science, 1988, 282(5393):14971501.