原发性和继发性胶质母细胞瘤中p53、p16和 Rb的表达及意义

　　作者：郭东生　　作者单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院神经外科

　　【摘要】 目的 探讨p53、p16和Rb基因在原发性和继发性GBM中的表达差异性及意义。方法 应用RTPCR和Westernblot检测14例原发性和16例继发性GBM中p53,p16 mRNA和蛋白表达,免疫组织化学法检测Rb表达。 结果 Rb免疫组织化学染色显示正常脑组织中无表达，14例原发GBM中有3例表达缺失(21.4%)，16例继发GBM中有2例表达缺失(11.1%)。RTPCR和Western blot 对比原发和继发GBM中p53和p16的表达, 发现所有继发GBM中p53表达强度较原发GBM明显增加，14例原发GBM中有5例缺失(36.0%)，继发GBM中仅有1例表达缺失(6.25%)。p16表达缺失明显减少。结论 Rb的表达缺失在原发和继发GBM中没有明显的差异。细胞周期调节基因p53在mRNA和蛋白水平表达增加和p16在同样水平表达缺失是原发与继发GBM重要的细胞周期调控基因上的变化,可能是基因治疗GBM的重要靶点之一。

　　【关键词】 胶质母细胞瘤 p53 p16 Rb

　　胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)是颅内常见的恶性肿瘤。因其恶性程度高，易复发, 生存质量差,而且死亡率高，日益受到重视。原发GBM在手术切除以后很快原位重新生长。目前认为恶性肿瘤是一种多基因变化、多步骤发生的细胞周期性疾病。其中细胞周期调控基因p53、 p16和Rb(retinoblastoma, Rb)在其中起着很重要的作用。本实验分析细胞周期调控基因p53、p16和Rb在原发性和继发性GBM中的表达异常，从而为基因治疗GBM打下理论基础。

　　1 资料与方法

　　1.1 资料

　　30例患者肿瘤标本来源于1999年12月～ 2005年12月在华中科技大学同济医学院附属同济医院行肿瘤切除术后所取的标本，术后切片行EGFR染色区分原发性和继发性GBM。并用脑外伤术后行内减压后正常脑组织作为对照，常规石蜡包埋、切片, 厚度为4～ 5μm。患者的特征。

　　1.2 方法

　　30例患者基本特征及Rb免疫组织化学染色结果

　　*为p16缺失表达的病例;M: Male, F: Female, Fr: Frontal, T: Temporal, P: Parietal; O: Occipital1.2.1 试剂 10%山羊血清,SP生物素标记二抗(工作浓度1∶100)为美国Zymed公司提供;p53一抗(鼠单克隆抗体,工作浓度为1∶400)、p16一抗(鼠单克隆抗体,工作浓度为1∶400)和Rb抗体(鼠单克隆抗体，工作浓度为1∶50)均购自美国NEOMARKS公司;DAB为美国DAKO公司提供。

　　1.2.2 免疫组织化学染色 采用SP法按常规步骤进行RB免疫组织化学染色,DAB显色,苏木素复染,脱水透明,封片。然后进行阳性细胞计数：阳性细胞数<5%记为“-”，5%～ 25%为“+”，25%～ 50%为“++”，>50%为“+++”。

　　1.2.3 RTPCR扩增 石蜡包埋的组织先用二甲苯脱蜡48h，其间更换一次二甲苯，再用Trizol一步法提取组织RNA，并用莫落尼鼠类白血病毒(murine moloney leukemia virus, MMLV)逆转录酶进行逆转录反应，以逆转录反应为模板，以βactin为内参照，引物序列及扩增片段大小。PCR反应总体积为20μl: 2.5mmol/L dNTP 2μl，25mmol/L MgCL2 2μl, Taq酶1.5U,10×Buffer 2μl, p53,p16和βactin上、下游引物各10pmol，cDNA模板1μl,去离子水10μl。其参数为95℃ 5min，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s为1个循环，共扩增35个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，以DL2000作为分子量标准，溴化乙锭染色后，在紫外光检测仪上观察结果。表2 p53、 p16和βactin引物序列及产物大小

　　基因名称引物序列 产物大小p53 sense 5’TTCCTCTTCCTACAGTACTA3’antisense 5’AGTTGCAAACCAGACCTCAG3’ 408bpp16 sense 5’GGAAATTGGAAACTGGAAGG3’antisense 5’CTGCCCATCATCATGACCTG3’ 167bpβactin sense 5’AACGGCTCCGGGCATGT3’antisense 5’CTTCTGACCATGCCCACCA3’ 108bp

　　1.2.4 蛋白的提取及Western blot分析 应用MPERTM哺乳动物蛋白提取试剂盒(Pierce公司)提取蛋白，取40μg细胞总蛋白样品进行SDSPAGE电泳，并转移至硝酸纤维素膜上;室温封闭2h后，用TBST缓冲液漂洗3次，加入上述p53、p16一抗工作液4℃孵育过夜，TBST漂洗3次后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温摇床孵育2h，化学发光增强试剂自显影后，暗室内X线底片感光成像。

　　1.3 统计学方法

　　应用SPSS11.0统计软件,采用χ2检验分析Rb在原发和继发GBM中的表达差异。采用Fisher’s精确概率法比较原发和继发GBM瘤之间的p53、p16的变化。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 免疫组织化学

　　正常对照脑组织没有发现Rb阳性染色，相对而言，大多数胶质母细胞瘤其细胞形态各异，但是明显可见Rb胞核染色，亦可见部分胞浆染色，如病例4，并且在原发(病例4、5、10)和继发(23、29)GBM中均发现Rb表达缺失，14例原发GBM有3例表达缺失，在16例继发GBM中有2例表达缺失。两者在统计学上差异并不明显(χ2=3.79, P=0.46)。

　　2.2 RTPCR及Western blot

　　发现所有继发胶质母细胞瘤p53在mRNA和蛋白水平的表达普遍比原发GBM高。在14例原发GBM中，有5例p16表达缺失(36.0%)，而在继发GBM中仅有1例表达缺失(6.25%)，两者在mRNA和蛋白水平均存在明显的统计学差异(P=0.0068)。

　　3 讨论

　　尽管近年来手术、放疗、化疗等综合治疗技术不断发展,但胶质母细胞瘤患者的预后仍然极差,治疗后平均生存时间少于1年[1]。根据EGFR基因的扩增,染色体17p上的杂合性丢失和(或)p53基因突变将GBM划分为三大类：原发性GBM，又称为Ⅱ型GBM，好发于老年患者,平均发病年龄55岁,临床病史较短(常小于6个月),以前没有较低级别胶质瘤的病史或组织学证据，其特征性分子遗传学改变是EGFR基因的扩增,而无染色体17p上的杂合性丢失和(或)p53基因突变; 继发性GBM，又称为Ⅰ型GBM,是从低级别或间变性星形细胞瘤发展而来，患者相对年轻(30～ 45岁)，其特征性分子遗传学改变是p53突变和17p上的杂合性丢失,而无EGFR基因的扩增，预后较原发性GBM好;其他类型GBM，如巨细胞GBM，临床上原发,虽无较低级别胶质瘤的病史,但其遗传学改变与继发性GBM相似，预后较其他GBM好[2]。

　　越来越多的研究证实细胞周期调控基因的失活是恶性肿瘤发生发展中的频发事件。目前已知与胶质瘤相关的细胞周期调控因子主要为p53和p16。两者分别通过p53/MDM2/p21通路及p16/p15/CDK4/CDK6/Rb通路发挥作用。有研究证实这两条通路上基因表达异常，尤其是p53和p16本身的突变和表达缺失在GBM的发生和发展中起重要的作用[36]。

　　肿瘤抑制基因p53所编码的蛋白质在细胞周期中对DNA损害的反应、细胞死亡、细胞分化和血管再生等方面起重要作用。研究已证实在原发和继发GBM中，p53的突变率并不相同，在继发GBM中，57%的突变集中在两个热点编码子区域：248和273，而在原发GBM中，仅仅只有17%发生在该区域，并且继发GBM CpG岛的G∶C→A∶T转位发生频率要比原发高得多[35,7,8]。本研究中，继发性GBM无论是在转录水平和蛋白水平其p53的表达均明显高于原发性GBM,证实了继发GBM细胞周期过程中p53对DNA损害的修复能力远比原发的强，这与临床上继发GBM的愈后较好相吻合。

　　Rb基因是位于13q14上的一个重要的肿瘤抑制基因，它编码核内磷酸化蛋白Rb。Rb的磷酸化状态为Rb基因调节细胞生长分化的主要形式，对细胞增殖起负调节作用。Rb蛋白是调控细胞周期由G1进入S期。有实验证明，85%的Rb表达丢失的GBM中有启动子高度甲基化，由此可见GBM中Rb启动子的高度甲基化是其功能丧失的主要机制。在继发性GBM中Rb启动子的甲基化高达43 %，显著高于原发性GBM中的14 %[911]。同时，Rb启动子高度甲基化并未在低恶性星形细胞瘤或间变星形胶质细胞中发现，这表明Rb基因表达的丢失出现于星形胶质细胞瘤进程中的较晚时期。大多数GBM中有较多不能进入细胞核的蛋白。并没有明显的证据显示Rb基因表达的丢失和Rb基因内的杂合性丢失有明显的联系[1,4,5,8]。本研究发现Rb在14例原发GBM有3例表达缺失，在16例继发GBM中有2例表达缺失。两者在统计学上差异并不明显(P=0.46),这与本研究的样本数过小有一定的关系。

　　p16是位于染色体9p21上的肿瘤抑制基因。p16编码一种细胞周期调节蛋白,这种蛋白与cyclin依赖激酶CDK4或CDK相结合后,可抑制CDK4/CDK6/cyclinD复合体对Rb蛋白磷酸化的催化作用,从而抑制细胞周期由G1进入S期。在不同类型的GBM中，其p16表达主要表现为表达缺失而不是突变。据报道，p16(CDK2/MTS1)基因的同源缺失发生于30%～ 60%的GBM中[3,59]，而p16突变在GBM中的发生率低于1%[3,7]，并且在不同类型的GBM中其同源缺失率是不一样的。研究证实在原发GBM中，表明p16同源缺失率要比继发GBM要高得多。本研究中，在14例原发GBM中，有5例p16表达缺失(36.0%)，而在继发GBM中仅有1例表达缺失(6.25%)，两者存在明显的统计学差异(P<0.01)，而且无论是在转录水平还是蛋白水平，p16均表现为缺失，表明p16/p15/CDK4/CDK6/Rb通路在GBM的发生发展中起某种重要作用，并且p16表达缺失对原发GBM的影响较继发GBM要大得多，提示p16可能是原发GBM细胞周期进程中的重要调控因子，能作为基因治疗的靶点。

　　原发性与继发性GBM细胞周期调控差异性的研究，不仅对两者的鉴别有重要意义，对各自的治疗方向也有明确的指导意义。可能还有一些与细胞周期调控相关的关键点尚未被发现，有待于进一步考证和研究。

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