脑脊液中脑膜癌细胞CEA表达的研究

　　作者：窦春阳,范学文,吴若芬,朱海清,孔繁元　　作者单位：宁夏自然科学基金资助项目(编号ZN0791) 宁夏医科大学附属医院，宁夏 银川 750004 南京医科大学附属脑科医院，江苏 南京 210029

　　【摘要】目的 联合应用免疫荧光细胞化学技术和激光扫描共聚焦显微镜技术(LSCM)检测脑脊液中脑膜癌细胞CEA的表达部位并定量测定其荧光含量，探讨该技术在脑膜癌病诊断中的价值。 方法 应用免疫荧光细胞化学法以CEA标记脑膜癌细胞及对照组脑脊液细胞，采用LSCM技术获得脑膜癌细胞扫描图像并定量测定CEA荧光强度值。结果 脑脊液中脑膜癌细胞的CEA表达为阳性，且部位在细胞浆中;CEA平均荧光值(36.80±17.17)，与对照组(4.87±1.86)相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论 联合应用免疫荧光细胞化学法和LSCM检测脑脊液细胞中CEA的表达可为脑膜癌病的诊断提供可靠依据。

　　【关键词】 脑膜癌病;脑脊液;CEA;激光扫描共聚焦显微镜;免疫荧光

　　Observation of CEA in meningeal carcinomatosis cells of cerebrospinal fluid by laser scanning confocal microscopy DOU Chun-yang, et al. 　(Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China)

　　[Abstract] Objective To investigated the cellular distribution and quantitatively of CEA in cerebrospinal fluid meningeal carcinomatosis cells by immunofluorescence staining and laser scanning confocal microscopy (LSCM), explore the diagnostic value of the examination in the patients with meningeal carcinomatosis.Methods All cerebrospinal fluid cells (control group and meningeal carcinomatosis) were stained with CEA by immunofluorescence, scanogram and fluorescent intensity stereophotography were obtained and finally fluorescent values of CEA were individually measured by LSCM.Results Compared with meningeal carcinomatosis cells(44.33±29.58)and control group cells (2.37 ± 2.16), fluorescent value difference CEA was statistically significant (P<0.01). Conclusion The sensitivity of CEA by immunofluorescence examination and LSCM is useful for the diagnosis,differential diagnosis of meningeal carcinomatosis.

　　[Key words] Meningeal carcinomatosis; Cerebrospinal fluid; Carcinoembryonic antigen; Laser scanning confocaI microscopy; Immunofluorescence

　　本研究联合应用免疫荧光细胞化学技术和激光扫描共聚焦显微技术对20例脑膜癌病(meningeal carcinomatosis,MC)患者的脑脊液细胞进行绿色荧光平均值(CEA)检测，以探讨该方法在MC诊断中的价值。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源：20例MC患者为2007年8月至2008年8月本院、南京脑科医院门诊及住院收治。男9例，女11例，平均年龄51岁。按肿瘤来源：肺腺癌10例、乳腺癌2例、绒毛膜癌1例、子宫内膜癌1例、恶性髓母细胞瘤2例、未找到原发病灶4例。16例转移癌病例均由组织病理证实。对照组20例均为同期本院神经内科住院收治，经脑脊液细胞学诊断为病毒性脑膜炎且随访已治愈。男8例，女12例，平均年龄41岁。

　　1.2 试剂与仪器：兔抗人CEA、FITC-羊抗兔IgG均购自北京博奥森生物技术公司;Cytospin-3型细胞玻片离心仪，英国Shandon公司生产;TCS-SP5型激光共聚焦扫描显微镜，德国Leica 公司生产，第三军医大学提供使用。

　　1.3 方法：

　　1.3.1 CEA标记：设肺腺癌胸水阳性对照组、PBS自发荧光对照组、PBS+二抗荧光标记物对照组。标本玻片以10%羊血清封闭30 min，滴加1∶100兔抗人CEA，置湿盒内37℃孵育1 h , 4℃过夜，再加入1∶20 FITC-羊抗兔IgG,避光置湿盒内37℃孵育1 h，滴加1∶1000 DAPI 室温10 min，甘油封片，以上每步骤间均以0.01M PBS漂洗3遍。

　　1.3.2 激光扫描共聚焦显微镜观察：分别用488nm和405nm波长的激光器激发绿色和蓝色荧光。CEA相对荧光含量检测结果以平均荧光值和荧光强度地形立体分布图表示。实验组及对照组各随机选取200个高倍镜视野的细胞，测定每个细胞内CEA含量的相对荧光值及细胞面积、周长。

　　1.4 统计学方法：本实验采用SPSS 11.5统计软件，组间比较采用t检验，P<0. 05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 LSCM扫描荧光图像及CEA的表达部位:脑膜癌细胞的胞浆内可见分布均匀的绿色荧光，CEA表达于胞浆;其余淋巴、单核细胞等仅见DAPI染色的蓝色细胞核，胞浆未着色。对照组脑脊液细胞仅见蓝色的细胞核，胞膜、胞浆及胞核内未见绿色荧光，提示无CEA表达

　   2.2 CEA荧光强度地形立体分布图:脑膜癌细胞图像为不规则的蛋糕形，中心凹陷呈火山口状，底部可见蓝色细胞核区域;胞浆区域呈环形，顶端不平坦，黄、红色山峰呈锯齿样突起，相对荧光含量由低到高(0→255)蓝→绿→黄→红。对照组脑脊液细胞地形平坦，仅见蓝色肾形细胞核区域，胞浆基本无荧光分布，单核细胞。

　　2.3 脑膜癌细胞与对照组脑脊液细胞CEA荧光相对含量及形态学参数比较:脑膜癌细胞与对照组脑脊液细胞CEA荧光含量相比差异有统计学意义(P<0.01)，脑膜癌细胞的面积、周长与对照组脑脊液细胞相比差异有统计学意义(P<0.01)。

　　两组脑脊液细胞EMA/CEA荧光相对含量及形态学参数的比较

　　3 讨论

　　MC是由于恶性肿瘤在蛛网膜下腔和软膜内弥漫性转移而引起的一系列临床综合征，在癌症患者中发生率为5%-8%，目前有上升趋势[1]。肺癌、乳腺癌、胃肠道癌是脑膜癌最常见的原发灶，腺癌是其主要组织类型[2]。脑膜癌病临床表现复杂，在脑脊液中找到脑膜癌细胞是诊断本病的最终标准[3]。据报道[4] MC患者首次腰穿发现肿瘤细胞的阳性率仅为45%-60%。

　　刘振华等[5] 报道常规CSF细胞学发现肿瘤细胞的阳性率为41.86%，应用CEA免疫细胞化学法可将阳性率提高到83.72%。Liu等[6]报道CEA等上皮来源的标记物在脑膜癌组的阳性例数为80%，在良恶性脑膜瘤组为0%，提示多抗体免疫组化检测可鉴别肿瘤细胞的组织来源。本实验MC组 CEA阳性率为90%(18/20);常规MGG染色阳性率60%(12/20)，两者相比差异有统计学意义(P<0.05)，提示免疫细胞化学染色可显著提高脑膜癌病的诊断率，与国内外研究一致。Martínez等[7]应用免疫荧光双标和LSCM技术对脑膜血管外皮细胞瘤中的抑癌基因进行了研究。岳剑宁等[8]用LSCM对脑脊液淋巴白血病细胞线粒体进行了立体、定量研究。LSCM观察可见细胞核与DAPI结合呈明亮的蓝色荧光，未见绿色荧光，提示胞核内无CEA表达;胞浆内可见分布均匀的明亮的绿色荧光，提示CEA表达于胞浆，与国内外报道一致[9]。从荧光强度地形立体分布图可见脑膜癌细胞胞核CEA含量极少，而胞浆内CEA含量较高，亦与上述分布相符。对照组细胞面积和周长相对较小，胞浆内CEA含量极低;而脑膜癌细胞面积和周长相对较大，胞浆内CEA含量较高，两组之间相比差异有统计学意义(P<0.01)。本实验MC组中2例髓母细胞瘤检测CEA阴性，与文献报道一致[10]。

　　【参考文献】

　　[1] Sulim S, Hoyer M. Meningeal carcinomatosis [J]. Ugeskrift for Laeger, 2005,167(37): 3481-3484.

　　[2] Toshihiro Suzuki, Hirofumi Sakaguchi, Satoshi Yamamoto,et al. Sudden hearing loss due to meningeal carcinomatosis fromrectal carcinoma [J].Auris Nasus Larynxr ,2006,33:315-319.

　　[3] N. Pavlidis. The diagnostic and therapeutic management of leptomeningeal carcinomatosis [J]. Ann Oncol ,2004,15 (Supplement 4):285-291.

　　[4] 邱雯静，杨欢，杨乐，等. 脑膜癌病的临床特点及脑脊液检查对其诊断的重要意义[J].卒中与神经疾病，2007，14(4)：217-219.

　　[5] 刘振华，陈建平，宋振海，等. 脑脊液EMA和CEA免疫细胞化学检查对脑膜癌病的诊断价值 [J]. 山东医药，2007，47(27): 101-102.

　　[6] Liu YL, Sturgis CD, Bunker M, et al. Expression of cytokeratin by malignant meningiomas: diagnostic pitfall of cytokeratin to separate malignant meningiomas from metastatic carcinoma [J]. Modern Pathol, 2004,17: 1129-1133.

　　[7] Martinez JC, Palomino JC, Samaniego R, et al. Retinoblastoma (Rb) tumor-suppressor pathway alterations in meningeal hemangiopericytomas: High E2F transcription factor 1 expression and loss of Rb expression: study by double immunofluorescence staining and laser-scanning confocal microscopy [J]. Cancer, 2008, 113(1):166-174.

　　[8] 岳剑宁，孔繁元，吴若芬，等. 应用共聚焦激光扫描显微镜对脑脊液淋巴白血病细胞线粒体的研究[J]. 北京医学，2005，27(4)：211-213.

　　[9] Susanne J, Monica EK, Britta W, et al. Intracellular Targeting of CEA Results in Th1-Type Antibody Responses Following Intradermal Genetic Vaccination by a Needle-Free Jet Injection Device [J]. The Scientific World, 2007,7: 987-999.

　　[10] 郑继培， 何泽生， 余英豪. 小脑蚓部髓母细胞瘤椎管内转移1例[J]. 中国误诊学杂志，2006，6(7)：1414.