人乳头瘤病毒16L1原核表达质粒的构建

　　作者：左凤琼,赵素兰,李婉宜,李晓红,吕梅励　　作者单位：1.四川大学华西基础医学与法医学院;2.四川省肿瘤医院;3.四川大学华西药学院;4.四川大学华西附二院，四川 成都610044

　 【摘要】目的：构建人乳头瘤病毒16L1的原核表达质粒，为下一步探讨蛋白的表达以及蛋白的功能研究作准备。方法：以临床HPV16阳性标本为模板，PCR扩增L1的片段，L1片段经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后,插入载体pGEX4T1，转化JM109感受态细胞，平板筛选获得pGEX4T1/HPV L1的阳性质粒。通过酶切、测序验证质粒的正确性。结果：构建了原核表达质粒pGEX4T1/HPV16L1，并通过酶切、测序等方法验证其完全正确。结论：成功构建的pGEX4T1/HPVL1为今后的蛋白的表达和功能研究打好了坚实的基础，为HPV16的疫苗研究提供了有益的支持。

　　【关键词】 人乳头瘤病毒16;质粒;构建

　　宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约有37万新发病例，有20万妇女死于宫颈癌。近年来，人乳头瘤病毒(human papillomaviruses，HPV)感染被认为与大多数宫颈癌发生和发展密切相关[1]。据报道，99%以上的宫颈部位肿瘤可检测到HPV DNA的存在。因此,研究HPV疫苗对于宫颈癌的预防和治疗具有重要作用。迄今已发现的乳头瘤病毒多达100多型，其中HPV16与宫颈癌关系最为密切。HPV癌蛋白E5、E6、E7具有刺激生长和转化功能[2,3]。E5是细胞膜或内膜整合蛋白。在感染细胞克隆早期的繁殖、扩张中起重要作用。HPV的外壳蛋白L1是保护性抗原,具有较强的保守性：在选择压力等外界作用下变异很小。不同型别蛋白氨基酸序列同源性高达60%。本课题选择HPV16的保护性抗原L1所在基因片段为目标，构建原核表达质粒，为获得具有预防宫颈癌作用的蛋白作准备。

　　1材料

　　主要仪器有凝胶成像仪购自Media Cybernetics(USA)公司，电泳仪购自BioMad公司。主要试剂：PremixTag,限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ、T4 DNA连接酶为TaKaRa产品,DNA相对分子质量标准(DL2000)为北京天为时代科技有限公司产品,DNA相对分子质量标准λDNA/HindⅢ为TaKaRa产品,胶回收使用上海华舜生物公司试剂盒Gel Extraction Min Kit。质粒提取使用Omega公司的E.Z.N.A Plasmid Mininprep KitⅠ。HPV16阳性患者子宫颈细胞来自四川大学华西妇产儿童医院。大肠杆菌JM109购自TaKaRa 公司。pGEX4T1质粒由本室保存。

　　2方法

　　2.1HPV16L1基因扩增根据GenBank中查得的东亚型HPV16全基因序列(基因登陆号AF534061)设计扩增HPV16 L1基因的上下游引物。上游引物5'GCGGAATTCATGCAGGTGACTTTTATTTACA3'，下游引物5'GCGGTCGACTAAAAATTTGCGTCCTAAAG3'上、下游引物5’端分别设有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点，所扩增的目的片段长度为1485 bp，引物合成由上海Invitrogen生物工程公司完成。以HPV16阳性子宫颈细胞DNA为模板克隆HPV16 L1基因。PCR扩增条件为94℃预变性4min，变性94℃30s,退火53℃35s,延伸72℃1.5min,最后72℃10 min后终止反应。

　　2.2HPV16L1原核表达质粒的构建对PCR产物和pGEX4T1载体分别用EcoRⅠ、SalⅠ双酶切和琼脂糖电泳回收目的片段，经T4连接酶16℃过夜连接HPV16L1和pGEX4T1。连接产物转化感受态细胞JM109，Amp平板筛选阳性克隆。阳性克隆经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切和PCR鉴定，获得初步正确的克隆。将该克隆送TaKaRa公司测序。

　　3结果

　　3.1PCR扩增HPVL1蛋白基因以HPV16阳性子宫颈细胞DNA为模板，用L1基因的特异引物进行PCR反应，PCR产物琼脂糖电泳结果。可见，2000bp与1000bp中间处有一明显条带，大小与预期值相符(1485bp)。

　　3.2 重组质粒酶切鉴定转化JM109之后，阳性菌落经EcoRⅠ或SalⅠ单酶切鉴定显示，产物为约5500bp的单一片段;用EcoRI和SalⅠ双酶切鉴定显示，产物为约5000bp和约1500bp的两个片段。结果表明，重组质粒单酶切的片段大小与理论值相符(5454)，双酶切后的大片段为载体片段，小片段为插入片段，均与理论值相符(大4969bp，小1485bp)。电泳结果。

　　3.3重组质粒插入基因的序列测定利用pGEX4T1通用引物对重组质粒的插入片段进行测序，结果显示重组质粒中插入的目的片段L1基因与Genbank报告的序列和氨基酸序相同，而且L1基因插入到真核表达载体中，插入的方向正确，未改变外源基因的阅读框架。进一步证实了重组质粒为阳性重组子。

　　4讨论

　　HPV型别繁多，有100多种，其中以HPV16在子宫颈癌中最为常见，占全部HPV的50%以上，其次是HPV18，约占18%[4]。有文章报道HPV16感染患者发生子宫颈癌的危险是无感染者的506倍[5]。

　　HPV是具有特异性嗜上皮细胞的DNA病毒,其基因主要包括E1E7早期基因和L1、L2晚期基因，前者主要是调控基因，具有转化作用。L1、L2是结构蛋白，具有强的抗原性，为预防性疫苗研究的热点。

　　本研究选择HPV16东亚型的保护性抗原L1为目的基因，构建了其原核表达质粒pGEX4T1/HPVL1，通过酶切，测序等方法验证了其正确性，为下一步HPV16L1蛋白的表达奠定了坚实的基础，为HPV16L1的保护性疫苗的研究提供了有益的支持。

　　【参考文献】

　　1 Bosch FX, lorincz A, Nuroz N, et al. The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer[J]. J Clin Pathol, 2002, 55(4): 244265.

　　2 Psyrri A, Defilippis RA, Edwards APB, et al. Role of the retinoblastoma pathway in senescence triggered by repression of the human papillomavirus E7 protein in cervical carcinoma cells[J]. Cancer Res,2004, 64(9): 30793081.

　　3 Nguyen DX, Westbrook TF, Mccance DJ. Human papillomavirus type16 E7 maintains elevated levels of the cdc25A tyrosine phosphatase during deregulation of cell cycle arrest[J].Virol, 2002, 76(2): 619633.

　　4 Mandeblatt JS, Lawrence WF. Gaffikin costs and benefits of different strategies to screen for cervical cancer in lessdeveloped countries[J]. J Natl Cancer Inst, 2002, 94(19): 14961503.

　　5 Franceschi S. Strategies to reduce the risk of virusrelated cancers[J]. Annals of Oncology, 2000, 11(9):10911096.