Calphostin C对乳腺癌细胞增殖的抑制作用及相关机制

　　作者：千新来,崔静,任峰　　作者单位：新乡医学院病理学教研室，河南新乡

　　【摘要】目的 研究Calphostin C对乳腺癌细胞MDAMB435S增殖的影响及初步机制。方法 通过观察Calphostin C处理MDAMB435S细胞前后细胞的生长速度、倍增时间、克隆形成率和细胞周期分布等变化，探讨Calphostin C对MDAMB435S细胞增殖的影响;通过Western blotting、免疫细胞化学染色和RTPCR等方法探讨Calphostin C影响MDAMB435S细胞增殖的初步机制。结果 与MDAMB435S亲本细胞(对照组)相比，Calphostin C处理的MDAMB435S细胞(实验组)生长速度明显减慢，倍增时间明显延长(P<0.01)，并且呈现浓度和时间依赖性;对照组和实验组细胞克隆形成率分别为(82.33±6.81)%和(22.00±1.73)%，差异有统计学意义(P<0.01);实验组细胞周期出现明显的G1期阻滞(P<0.01)。Western blotting和免疫细胞化学染色结果显示，与对照组细胞相比，实验组细胞中蛋白激酶Cα(protein kinase Cα, PKCα)表达没有明显变化，但活性状态(胞质转位至胞膜)的PKCα显著减少。Western blotting和RTPCR结果显示，与对照组细胞相比，实验组细胞中p53、Cyclin A和Cyclin B表达没有明显变化，但p21表达上调，Cyclin E表达下调。结论 Calphostin C可显著抑制乳腺癌细胞MDAMB435S的增殖，该作用可能与其抑制PKCα活性、上调p21表达和下调Cyclin E表达有关。

　　【关键词】 钙磷酸蛋白C;蛋白激酶C;乳腺癌;增殖

　　Inhibition of Calphostin C on the proliferation of breast carcinoma cells and its mechanism

　　QIAN Xinlai, CUI Jing, REN Feng, ZHAO Jie, YE Yaping, HE Guoyang, LI Xinqiang,ZHU Huifang, HAN Fangyi, YANG Huilin, WANG Xia, YUAN Zhiqing

　　(Department of Pathology, Xinxiang Medical College, Xinxiang 453003, China)ABSTRACT: Objective To explore the effects of Calphostin C on the proliferation of breast carcinoma cells (MDAMB435S) and its preliminary mechanism. Methods The effects of Calphostin C on the proliferation of MDAMB435S cells were studied by observing changes of the growth rate, doubling time, cloneforming efficiency, and distribution of cell cycle of MDAMB435S cells before and after Calphostin C treatment. Furthermore, the mechanism involved was analyzed by Western blotting, immunocytochemistry and RTPCR assay. Results Compared with those of the parental MDAMB435S cells (control group), the growth rate was suppressed markedly and the doubling time was prolonged significantly (P<0.01) in the MDAMB435S cells treated with Calphostin C (experimental group), and the changes presented concentration and timedependence patterns. Furthermore, the cloneforming efficiency in control group and experimental group was (82.33±6.81)% and (22.00±1.73)%, respectively, with a significant difference (P<0.01). Moreover, for the experimental group cells, the cell cycle arrested in G1 phase (P<0.01). The results from Western blotting and immunocytochemical staining indicated that compared with that of the parental MDAMB435S cells, the expression of protein kinase Cα (PKCα) did not change significantly, but PKCα in active status (transposition from cytoplasm to cytomembrane) was decreased dramatically in the MDAMB435S cells treated with Calphostin C. Western blotting and RTPCR results showed that compared with that of the parental MDAMB435S cells, the expression of p53, Cyclin A and Cyclin B had no significant changes, while the expression of p21 was increased and the expression of Cyclin E was decreased in the MDAMB435S cells treated with Calphostin C. Conclusion Calphostin C could suppress markedly the proliferation of MDAMB435S cells, which may be correlated to the abilities of inhibiting PKCα activity, upregulating the expression of p21 and downregulating the expression of Cyclin E.

　　KEY WORDS: Calphostin C; protein kinase C; breast carcinoma; proliferation

　　肿瘤细胞过度增生与有丝分裂信号途径相关基因过度表达密切相关，而蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)的过度激活在后者中起重要作用[1]，提示PKC的过度激活可能与肿瘤的发生发展有关。越来越多的证据显示,多种肿瘤(如乳腺癌、恶性神经胶质瘤等)组织中PKC的表达和活性都远高于相应的正常组织[2]。因此，PKC是一个潜在的有价值的抗肿瘤治疗靶点[1]。PKC特异抑制剂钙磷酸蛋白(Calphostin)是一类菌类分支孢子菌属分子孢子提取物，以Calphostin C最具代表性[34]。乳腺癌的发生率在世界范围内仍呈上升趋势，我国乳腺癌发生率增加速度(3%～5%)明显高于世界平均水平(1.5%)[5]。鉴于以上研究及国内、外尚未见Calphostin C对乳腺癌作用的相关报道，本研究拟以乳腺癌细胞MDAMB435S为研究对象，探讨Calphostin C对乳腺癌细胞增殖的影响和初步机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 主要试剂

　　Calphostin C为美国Calbiochem公司产品;胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)为杭州四季青公司产品;逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptionpolymerase chain reaction, RTPCR)试剂盒、Taq DNA聚合酶和dNTPs等为美国Promega公司产品;Trizol试剂、蛋白分子量标准、100bp DNA Markers和DMEM/F12培养基等为美国Invitrogen公司产品;二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺和吉姆萨染料等为美国Sigma公司产品;DBA试剂盒和增强化学发光(enhanced chemiluminescence, ECL)试剂盒购自中杉生物技术有限公司;PKCα鼠抗人单克隆抗体和通用型PV6000两步法免疫细胞化学试剂盒为美国Zymed公司产品;Cyclin E兔抗人多克隆抗体、p21和βactin鼠抗人单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品。PCR引物由上海生物工程有限公司合成。 引物序列和目的片段

　　1.1.2 细胞系及培养条件

　　乳腺癌细胞系MDAMB435S购于中国科学院上海细胞库，培养条件为含100mL/L FBS和青/链霉素(青霉素100u/mL、链霉素100mg/L)的DMEM/F12培养基，于37℃、50mL/L CO2孵箱中培养。

　　1.1.3 Calphostin C的配制

　　用DMSO溶解Calphostin C，配制为100μmol/L，-20℃避光保存备用。

　　1.2 方法

　　1.2.1 生长速度和倍增时间的检测

　　取对数生长期MDAMB435S细胞接种24孔板(2×104/孔)，常规培养24h后，更换为含不同浓度Calphostin C(0.05、0.10、0.25、0.50nmol/L和1.00nmol/L)的培养基，设不加药组和DMSO对照组。各组均设3个复孔，每天每个浓度计数3孔细胞，共计数6d，求均值，绘制细胞生长曲线，并按公式TD=t×log2/(logNt-logN0)计算倍增时间(TD)，t代表培养时间，N0代表起始计数获得的细胞数，Nt代表培养t时间后计数获得的细胞数。

　　1.2.2 克隆形成率的检测

　　取对数生长期MDAMB435S细胞接种6个培养瓶(1×102/瓶)，常规培养24h后，随机选择其中3瓶更换为含0.1nmol/L Calphostin C的培养基，3h后再更换为不含Calphostin C的培养基(实验组)，另外3瓶作为对照组。培养21d后，用甲醇固定，吉姆萨染色，计数克隆数(≥50个细胞/克隆)，求均值，并计算克隆形成率(克隆形成率=平均克隆数/接种细胞数×100%)。

　　1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期

　　取6瓶对数生长期MDAMB435S细胞，随机选择其中3瓶更换为含0.1nmol/L Calphostin C的培养基(实验组)，另外3瓶作为对照组。3h后收集细胞，固定、染色后应用流式细胞仪测定DNA含量，计算机分析细胞周期并绘制细胞周期分布直方图。

　　1.2.4 免疫细胞化学染色分析PKCα蛋白分布的变化

　　接种对数生长期MDAMB435S细胞于6张载玻片上，常规培养24h后，随机选择其中3张更换为含0.1nmol/L Calphostin C的培养基(实验组)，另外3张作为对照组。3h后取出载玻片进行免疫细胞化学染色。按Zymed公司的PV6000两步法免疫细胞化学试剂盒说明书进行。PKCα单克隆抗体稀释倍数为1∶50，PBS代替Ⅰ抗作为阴性对照。

　　1.2.5 RTPCR检测细胞周期相关基因mRNA水平的变化

　　用Trizol试剂提取对数生长期的MDAMB435S亲本细胞(对照组)和Calphostin C(0.1nmol/L)处理3h的MDAMB435S细胞(实验组)总RNA并定量，体外逆转录合成cDNA的第一条链，以cDNA为模板进行PCR反应，检测cyclin A、cyclin E、cyclin B、p53和p21等基因mRNA水平表达的变化。引物和目的片段长度见表1。反应条件为：94℃预变性2min，后接由94℃变性45s、50～55℃退火45s和72℃延伸45s构成的25个循环，最后72℃延伸5min。产物以18g/L琼脂糖凝胶电泳后观察并照相。以甘油醛3磷酸脱氢酶(glyceraldehyde3phosphate dehydrogease, GAPDH)为内参照。

　　1.2.6 Western blotting检测PKCα和细胞周期相关基因蛋白水平的变化

　　按分子克隆方法[6]提取对数生长期的MDAMB435S亲本细胞(对照组)和Calphostin C(0.1nmol/L)处理3h的MDAMB435S细胞(实验组)总蛋白并通过Bradford方法进行定量，通过Western blotting分析PKCα、cyclin E和p21等基因蛋白水平表达的变化。以βactin为内参照。

　　1.2.7 统计学分析

　　实验数据以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS11.5统计软件进行分析。多样本均数的比较采用单因素方差分析，两样本均数的比较采用t检验，检验水准为α=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 Calphostin C对MDAMB435S细胞增殖的影响

　　2.1.1 Calphostin C对MDAMB435S细胞生长的影响

　　生长曲线结果显示，与MDAMB435S亲本细胞和DMSO处理的MDAMB435S细胞(对照组)相比，不同浓度Calphostin C处理的MDAMB435S细胞(实验组)生长速度明显减慢，倍增时间明显延长，并且呈现浓度和时间依赖性(图1)。MDAMB435S亲本细胞、DMSO处理的MDAMB435S细胞以及0.05、0.10、0.25nmol/L Calphostin C处理的MDAMB435S细胞倍增时间分别为(22.93±1.72)h、(24.68±1.98)h、(47.54±1.37)h、(88.16±10.70)h和(1605.05±15.53)h (F=20042.56, P=0.000)。

　　根据细胞形态改变(另文报道)和生长曲线结果，后续实验中均以MDAMB435S亲本细胞作为对照组，0.1nmol/L Calphostin C处理3h的MDAMB435S细胞作为实验组。

　　2.1.2 Calphostin C对MDAMB435S细胞克隆形成率的影响

　　接种细胞21d后，MDAMB435S亲本细胞(对照组)和Calphostin C处理的MDAMB435S细胞(实验组)分别平均形成(82.33±6.81)和(22.00±1.73)个细胞克隆，克隆形成率分别为(82.33±6.81)%和(22.00±1.73)%(t=12.287，P=0.007)。另外，与对照组相比，实验组形成的克隆体积也较小。

　　2.1.3 Calphostin C对MDAMB435S细胞周期的影响

　　细胞周期直方图结果显示，与MDAMB435S亲本细胞(对照组)相比，Calphostin C处理的MDAMB435S细胞(实验组)出现明显的G1期阻滞(P<0.01)，G2/M期细胞比例显著减少(P<0.05)，S期细胞比例也呈明显减少趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。 Calphostin C(0.1nmol/L)处理3h后MDAMB435S细胞周期的变化

　　2.2 Calphostin C抑制MDAMB435S细胞增殖的初步机制

　　2.2.1 Calphostin C对PKCα活性的抑制作用

　　Western blotting分析结果显示(以βactin为内参照)，MDAMB435S亲本细胞(对照组)和Calphostin C处理的MDAMB435S细胞(实验组)中，PKCα表达在蛋白水平没有明显变化。由于静息状态的PKCα位于胞质，激活时从胞质转位至胞膜，因此，通过免疫细胞化学染色进一步分析PKCα的分布状态，结果显示，对照组细胞胞膜和胞质均呈明显阳性染色，而实验组细胞胞质仍呈明显阳性染色，但胞膜染色呈弱阳性或无染色。提示Calphostin C可显著抑制PKCα的活性。

　　2.2.2 细胞周期相关基因mRNA水平表达的变化

　　RTPCR结果显示(以GAPDH为内参照)，与MDAMB435S亲本细胞(对照组)相比，Calphostin C处理的MDAMB435S细胞(实验组)中，p53、Cyclin A和Cyclin B表达没有明显变化，但p21表达上调，Cyclin E表达下调。

　　2.2.3 细胞周期相关基因蛋白水平的变化

　　鉴于RTPCR结果，通过Western blotting进一步分析Calphostin C对p21和Cyclin E蛋白水平表达的影响。结果显示(以βactin为内参照)，与MDAMB435S亲本细胞(对照组)相比，Calphostin C处理的MDAMB435S细胞(实验组)中，p21表达上调，Cyclin E表达下调，进一步证实了RTPCR结果。

　　3 讨论

　　PKC是丝氨酸苏氨酸激酶家族的成员，处于多种信号转导途径的交叉口，对于多种信号由胞质到胞核的传递至关重要。过度增生是肿瘤的特征之一，这可能与有丝分裂信号途径相关基因过度表达有关，而后者与PKC的过度激活有关[1]。研究结果显示，PKC的过度表达可能促进细胞增生、抑制细胞凋亡[12]。因此，PKC的过度激活可能在肿瘤的发生发展中起重要作用。越来越多的证据显示，多种肿瘤，如乳腺癌、恶性神经胶质瘤等中PKC的表达和活性都远高于相应的正常组织[2]。这就促使人们去研究PKC抑制剂在肿瘤治疗中的意义。

　　Calphostins是菌类分支孢子菌属分子孢子提取物，属于二萘嵌苯醌，是选择性较强的PKC抑制剂。以Calphostin C最具有代表性，其对大多数PKC异构体均有抑制作用[34]。Calphostins抑制PKC的机制是共价修饰其脂质结合调节区和与甘油二酯竞争结合甘油二酯的结合位点[34]。本研究Western blotting和免疫细胞化学染色结果显示，与MDAMB435S亲本细胞相比，用Calphostin C处理的MDAMB435S细胞中，虽然PKC的表达没有明显变化，但其活性明显降低。提示Calphostin C可显著抑制PKC的活性。

　　生长速度、倍增时间、克隆形成率和细胞周期分布等是评价肿瘤细胞恶性生物学行为的重要指标。本研究结果显示，与MDAMB435S亲本细胞(对照组)相比，Calphostin C处理的MDAMB435S细胞(实验组)生长速度明显减慢，倍增时间明显延长，并且呈现浓度和时间依赖性;对照组细胞和实验组细胞克隆形成率分别为(82.33±6.81)%和(22.00±1.73)%;实验组细胞出现明显的G1期阻滞，G2/M期细胞比例显著减少，S期细胞比例也呈明显减少趋势。这不仅表明PKC与乳腺癌细胞MDAMB435S增殖能力密切相关，也说明Calphostin C能显著抑制MDAMB435S细胞的增殖能力。

　　细胞异常增殖是肿瘤发生与演进的关键，而细胞周期调控异常在肿瘤细胞异常增殖中具有重要作用。细胞周期素(Cyclins)是一类重要的细胞周期调控蛋白，与细胞增殖、分化及肿瘤的发生密切相关。其中Cyclin D和E等在G1期和G1/S转换时发挥作用;而Cyclin A和B等在G2/M转换和有丝分裂期起重要作用[7]。本研究Western blotting和RTPCR结果显示，与对照组细胞相比，实验组细胞中Cyclin A和Cyclin B表达没有明显变化，但Cyclin E表达下调。这与细胞周期分析结果显示的Calphostin C处理的MDAMB435S细胞出现明显的G1期阻滞是一致的。

　　研究显示，野生型p53在维持细胞生长、抑制肿瘤增殖过程中起重要作用[8]。p53的下游靶基因是p21Waf1，后者是细胞周期蛋白与细胞周期蛋白依赖激酶的广泛抑制物，其可通过抑制CyclinCDK复合物，引起细胞周期G1期阻滞，从而抑制细胞增殖[910]。本研究Western blotting和RTPCR结果显示，与对照组细胞相比，实验组细胞中p53表达没有明显变化，但p21表达上调。提示在Calphostin C诱导MDAMB435S细胞周期G1期阻滞中，Cyclin E和p21可能起协同作用。另外，鉴于Calphostin C处理细胞前后p53表达没有明显变化，因此Calphostin C上调p21表达的机制尚有待进一步研究。

　　综上所述，本研究证明了Calphostin C可显著抑制乳腺癌细胞MDAMB435S的增殖，该作用可能与其抑制PKCα活性、上调p21表达和下调Cyclin E表达有关。本研究为Calphostin C在乳腺癌治疗中应用的可能性提供了初步的依据。

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