抑癌基因甲基化与肺癌

　　作者：景志亮,赵颖海　　作者单位：广东医学院病理学教研室，广东 湛江

　　【关键词】 抑癌基因甲基化;肺肿瘤;诊断;治疗

　　肺癌是当今世界发病率与死亡率位于前列的恶性肿瘤之一。肺癌的发生是一个多步骤，多因素参与的复杂的生物学过程，涉及基因和基因外的多种改变，基因改变是指基因本身结构的异常，方式突变、基因缺失、扩增、重排等;基因外改变即表观遗传学改变。DNA甲基化是最重要的一种表观遗传修饰方式，通过调节癌基因激活、抑癌基因失活和染色体的不稳定性，在肿瘤发生过程中起了关键性的作用。DNA甲基化是指在 DNA甲基转移酶 (DNMT)的催化下，在胞嘧啶C的第五位碳原子上加一甲基基团,使之变成 5甲基胞嘧啶 (5mC)的化学修饰过程，不改变基因序列但影响基因表达，是在真核生物体内普遍存在的一种基因内源修饰作用。随着对肺癌相关基因甲基化研究的不断深入，发现抑癌基因甲基化异常对肺癌的临床早期诊断、预后判断及治疗等方面有重要意义,现就其研究现状作一综述。

　　1 肺癌相关的异常甲基化抑癌基因

　　目前已经发现一系列与肺癌相关的抑癌基因，由于发生异常甲基化而导致转录失活。虽然导致各种抑癌基因失活的机制不尽相同，但大多是通过调节细胞周期和凋亡、信号转导、DNA错配修复等方式进行或与转移/浸润有关。抑癌基因启动子甲基化与肺癌发生发展的关系受到越来越多的重视。

　　1.1 p16基因 又称多肿瘤抑制基因(MTS1)，是人类肿瘤中最常见的抑癌基因，是细胞周期蛋白激酶抑制剂。人pl6基因定位于9p21,全长815kb,其基因产物为p16INK4a和p19ARF。p16INK4a在多种肿瘤中表达失活，以基因突变、启动子区甲基化或纯合缺失为主要失活方式，其甲基化频繁发生于非小细胞肺癌(NSCLC)。通过分析吸烟和不吸烟NSCLC患者肺组织p16甲基化状况，发现吸烟者甲基化频率显著增加，且鳞癌比腺癌患者甲基化频率更显著 [1]。Palmisano[2]等人通过对确诊为肺鳞癌的吸烟患者进行痰标本检测和追踪调查，发现可以提前3年检测出p16基因和MGMT基因的异常甲基化。可见p16甲基化与肺癌的发生、早期监测有相关性。

　　1.2 DAPK (Death associated protein kinase)基因 即死亡相关蛋白激酶基因，是一种钙调蛋白调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,通过抑制细胞粘连、转移和促进细胞凋亡发挥肿瘤抑制功能。人DAPK基因定位于9q34。为了证明肺癌发生中相关的遗传机制和表观修饰之间的关系，Liu Y[3]等分析了122例NSCLC患者手术切除的肺癌标本中的RASSF1A和DAPK基因启动子甲基化的状况，以及对照组中原癌基因Kras和抑癌基因p53的突变率情况，结果表明肺癌中这些改变频繁发生，但彼此是相互独立的事件，即DAPK基因启动子甲基化作为一种非遗传的表观修饰在肺癌发生中单独起一定的作用。

　　1.3 FHIT(fragile histidine triad)基因 即脆性组氨酸三联体基因，是一个候选抑癌基因，定位于3pl4.2。它存在于人类所有正常组织，主要通过参与细胞周期调控和凋亡发挥作用。余宗涛[4]等探讨FHIT基因表达水平及其启动子CpG岛甲基化状态与肺癌发生发展的关系，发现FHIT mRNA在肺癌旁组织中全部表达,在肺癌组织中表达缺失率为48.89%(22/45),且FHIT基因启动子在肺癌组织中发生甲基化的频率为40%(18/45)、在癌旁组织中频率8.7%(2/23)，18份启动子区甲基化的肺癌标本中,10份同时伴有mRNA表达缺失，说明在肺癌组织中,FHIT基因启动子甲基化频率明显升高,其表达缺失或下调,提示FHIT启动子甲基化可在肺癌发生和发展中起一定作用，并可以作为危险因素检测的指标。

　　1.4 4.1B/DAL1 (Differentially expressed in Adenocarcinoma of Lung)基因 是Tran[5]等通过差异显示PCR的方法从原发肺癌组织中分离得到的一个公认的肿瘤抑制基因。4.1B/DAL1是蛋白4.1家族的成员，定位在人染色体18p11.3区域。4.1B/DAL1参与了正常细胞的生长和增殖调控，4.1B/DAL1的表达，对于细胞间的粘附，信号传导具有重要的意义. 目前，已经证明肺癌中存在4.1B/DAL1表达缺失和染色体18pll.3区域的杂合缺失，而且在一些非小细胞肺癌细胞株中重新表达4.1B/DAL1能够导致肿瘤生长抑制。Shinji 等[6]通过进一步研究表明，肺癌中DAL1表达缺失与抑癌基因启动子甲基化关系十分密切。并且，肺腺癌患者中，肿瘤基因甲基化者其无瘤生存率和总存活率显著缩短。这种研究提示DAL1基因甲基化不仅与非小细胞肺癌的发生和演进有关，1还可以作为一种预后的指标。

　　1.5 RASSF1A基因 即Ras相关区域家族1A基因，为一个存在于染色体3p21.3的抑癌基因。现已明确RASSF1A在肺癌中表达失活是其启动子特异性高甲基化所致。NSCLC患者血清中RASSF1A启动子异常甲基化检出率为30.7%(23/75)，而在肺的良性病变和健康捐献者的血清中未检出一例(0/50)[7]。研究结果表明，RASSF1A启动子超甲基化在NSCLC患者中频繁发生，提示RASSF1A可能有望作为肺癌的一种诊断和预后估计的新的生物标记。

　　1.6 APC (adenomatous polyposis coli,APC) 基因 位于染色体5q21，其表达的蛋白产物是Wnt信号传导途径的一种重要组成部分，能与β连环蛋白结合并使之失活。大量研究表明其表达降低与肿瘤直接相关，而启动子高甲基化可使APC基因失活，不表达或低表达APC蛋白。Grote[8]等在71%NSCLC和38%SCLC中检出APC启动子基因异常甲基化，经定量分析发现，NSCLC患者支气管抽吸物检测出更显著的高甲基化水平，其区分肿瘤和非肿瘤的特异性为98.5%，敏感度39%，推测APC基因甲基化的定量分析可能作为原发性肺癌的生物标记。

　　1.7 hMLH1基因 即人类mut1同源物基因，通过矫正错配变异的DNA，恢复基因的正常功能而发挥抑癌基因的作用。hMLH1基因的变异将导致一系列恶性肿瘤的发病率上升。杨振华[9]等研究表明hMLH1在NSCLC中经常表达缺失，而启动子甲基化是调节hMLH1转录活性的重要机制，提示hMLH1在NSCLC发生发展中发挥重要作用。

　　1.8 MGMT(O6methylguanineDNA methyltransferase，MGMT) 即O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶，是一种高效DNA直接修复酶，能修复DNA序列中6氧甲基鸟嘌呤损伤，是人类细胞中迄今发现的唯一一种修复该损伤的甲基转移酶，对维持基因组稳定性有重要意义。研究表明MGMT启动子异常甲基化是肺癌早期进展过程中经常发生的事件，并且 MGMT甲基化在非吸烟者中检出率明显高于吸烟者[10]。Palmisano[2]等人对确诊为肺鳞癌的吸烟患者进行痰标本检测和追踪调查，发现可以提前3年检测出MGMT和P16基因的异常甲基化。MGMT与肺癌发生、早期监测有相关性。

　　1.9 CDH 1(cadherin1)基因 是钙粘素超家族的典型基因，位于染色体16q22.1。其编码的蛋白称为E 钙粘蛋白(ECad)，是一个跨膜糖蛋白，介导细胞间的黏附作用，在上皮的极性和完整性维持等方面起着重要作用，其分子功能部分由β连环蛋白(βcatenin)介导。研究发现Ecad表达与增加组织分化有关，表达减少与淋巴结转移密切相关，而βcatenin表达减少则肺癌患者的生存率显著降低[11]，提示CDH1在肺癌的演进中起重要的作用，分析ECad和βcatenin的表达能够为肺癌的临床基础治疗和预后提供重要的依据。

　　1.10 CDH13基因 是钙粘素超家族的又一成员，位于染色体16q24.23，编码蛋白H-钙粘蛋白(HCad)，其在许多恶性肿瘤中表达降低，可能起着肿瘤抑制基因作用。研究发现，肺癌患者外周血可检测到CDH13基因超甲基化，而健康人群却没有[12]，提示血清CDH13启动子甲基化可作为一种检测早期肺癌的方法。

　　1.11 TIMP3( Tissue inhibitor of metalloproteinase3)基因 即金属蛋白酶组织抑制剂3，属于金属蛋白酶组织抑制剂家族(TIMPs)的一员，定位于22q12.3区域。这个家族具有对抗基质金属蛋白酶(MMP)活性作用，能够抑制肿瘤生长、血管发生、侵袭及转移。TIMP3的缺失被认为与肿瘤的发生有关。研究表明在从人类癌瘤获得的细胞株中，TIMP3表达失活与基因异常启动子区域甲基化相关。TIMP3异常甲基化可发生于原发肾、脑、结肠、乳腺和肺肿瘤中，而在41例正常组织中无一例发生[13]。TIMP3的表达情况与肿瘤的病理分级、结节浸润密切关联，可作为NSCLC患者手术切除的一个独立的预后因素。

　　1.12 RARβ(Retinoic acid receptor β) 即维甲酸β受体基因,与肿瘤的分化及恶性转化有关,是一种潜在的肿瘤抑制基因。刘晓黎[14]等通过观察经顺维甲酸(9cisRA)处理前后肺癌组织和对照肺组织维甲酸受体α、β及维甲酸类受体α转录水平的变化，证明肺癌组织中RARβ受体表达异常可能与肺癌发生有关。另有研究表明，在经相关环境因素暴露下诱导的肺癌裸鼠模型中，RARβ的异常甲基化是一种早期且常见的改变[15]。这些研究结果提示，RARβ受体的异常甲基化可作为肺癌早期检测的一项指标。

　　1.13 SEMA3B(Semaphorins) 信号素SEMA3B是定位于3p21.3区域的候选抑癌基因。目前的研究表明， SEMA3B作为一种抑癌基因，以等位基因缺失及启动子区域甲基化的形式使其表达失活频繁发生在肺癌中。Tamotsu[16]等的研究证实，SEMA3B基因的变化，通过“二次打击”学说，包括后天修饰和等位基因缺失致使抑癌基因失活，可能在NSCLC的恶性转化方面起重要作用。这些研究结果提示，SEMA3B启动子区域甲基化可作为肺癌发生的一项检测指标。

　　2 多基因甲基化联合检测在肺癌早期诊断及预后判断中的意义

　　从上述报道中可以看出，肺癌相关抑癌基因异常甲基化的研究,对肺癌尤其是NSCLC具有一定的早期诊断及预后判断的价值。尽管有些抑癌基因在NSCLC中的甲基化发生的频率偏低,但是对这些基因的联合检测可以极大地提高肿瘤的阳性检出率或预后判断价值。

　　有研究表明，单独根据ECad或HCad发生甲基化的频率与NSCLC患者的总体生存率没有显著差异，但两者同时发生超甲基化的患者生存率明显提高[17]。这提示，对于NSCLC患者，ECad和HCad基因同时发生甲基化的联合监测可作为一种较可靠的预后指标。

　　在林勍[18]等的研究中，NSCLC患者血清DAPK基因甲基化检出率为30.3% (27 /89),p16基因甲基化检出率为43.8% (39 /89),联合检测两基因甲基化检出率为76.4% (68 /89),而正常对照组和良性肺部疾病组血清未检出DAPK基因、p16基因甲基化，结果提示DAPK基因、p16基因检出启动子区域异常甲基化是NSCLC早期辅助诊断的分子标志物之一，联合检测两基因优于各单基因检测。

　　Anglim[19]等通过用敏感的高通量DNA甲基化分析技术MethyLight,检测了45例肺鳞状上皮细胞癌患者癌组织及癌旁正常肺组织中42个基因位点的甲基化状态。结果显示肺癌组织中22个基因位点表现出比非瘤组织中更显著的高甲基化水平，其中有8种基因(GDNF,MTHFR,OPCML,TNFPSF25,TCF21,PAX8, PTPRN2 and PITX2)表现出非常显著的超甲基化水平。用这8种基因位点的联合体标本联合检测，显示出95.6%的敏感性和特异性。可见采用对多个基因甲基化进行联合检测对肺癌具有很好的临床应用前景，还可以构建“甲基化基因谱”用于肺癌高危人群的筛查。

　　3 针对肺癌抑癌基因甲基化的治疗

　　3.1 DNA甲基转移酶抑制剂 由于甲基化并不改变DNA碱基序列，可以发生逆转，近年来人们将注意力集中在DNA甲基转移酶小分子抑制剂的研发上。DNA甲基转移酶及其关联的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，通过重激活肿瘤抑制基因和诱导细胞凋亡显示出抗增殖的效应。5氮杂胞苷(5azacytidine)及5脱氧胞苷酸(5aza deoxycytidine)是目前常用的甲基转移酶抑制剂。已有研究表明,肺癌中因启动子区发生甲基化而去表达的抑癌基因,经去甲基化药物5脱氧胞苷干预后可以恢复表达。Cantor[20]等人的试验，通过遗传后修饰调节恢复肿瘤抑制基因的表达，体现了甲基转移酶抑制剂用于肺肿瘤防治的潜力和前景。

　　3.2 RNA干扰技术与小干扰RNA RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是近年来发展起来的新技术，是一种在生物体细胞内,由特异的内源性或外源性双链RNA ( doublestranded RNA,dsRNA)诱发其同源信使RNA(messenger RNA,mRNA)降解的基因沉默机制。特异的dsRNA被特异核酸酶切割成21～23个碱基对的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA),转染至靶细胞后与细胞内的内切酶形成RNA诱导沉默复合体。DNA甲基化主要是由DNA甲基转移酶(DNMT)催化的,DNMT活性增加可使DNA发生异常甲基化、基因活性改变和染色体不稳定。DNMT1作用于半甲基化(母链甲基化而子链未甲基化)的DNA而催化其甲基化。Suzuki等[21]实验显示人NSCLC细胞系NCIH1299中,用DNMT1siRNA抑制了DNMT1的表达,减少启动子区域甲基化,从而使抑癌基因p16INK4A、CDH1、RASSF1A重新激活，提示siRNA可能成为肺癌治疗的一种新途径。

　　4 展 望

　　DNA甲基化与肺癌发生发展的关系是近年研究较热的课题。目前对DNA甲基化的研究还处在起步阶段，DNA甲基化发生的原因及确切机理还不清楚，肿瘤抑癌基因甲基化与肺癌间的对应关系还不明确。随着越来越多的与肺癌相关的异常甲基化基因的发现和研究，肺癌特异性的分子标记物的联合检测为肺癌的早期诊断提供了新的思路。而表观遗传修饰的可逆转，为肺癌治疗新途径的探索提供了启示和方向。因此，对与肺癌相关抑癌基因甲基化的进一步研究具有十分美好的前景。

　　【参考文献】

　　[1] Nakata S,Sugio K,Uramoto H，et al. The methylation status and protein expression of CDH1，pl6(INK4A)，and fragile histidine triad in nonsmall cell lung carcinoma: epigenetic silencing，clinical features,and Prognostie significance[J]. Cancer,2006,106(10):2190～2199.

　　[2] Palmisano WA,Dvine KK,Saccomanno G,et al. Predicting lung cancer by detecting aberrant promoterm ethylation in sputum[J]. Cancer Res,2000,60: 5954～5958.

　　[3] Liu Y,Lan Q,Gao W,et al. Promoter methylation of RASSF1A and DAPK and mutations of Kras and p53 in nonsmall cell lung cancer patients[J]. Proc Amer Assoc Cancer Res,2006,47.

　　[4] 余宗涛，袁亚莉，张吉才，等. 肺癌组织细胞 FHIT 基因启动子甲基化和转录表达 [J]. 肿瘤防治研究，2007,34(7):498～500.

　　[5] Tran YK,Bogler O,Gorse KM,et al. A novel member of the NF2/ERM/4.1 superfamily with growth suppressing properties in lung cancer[J]. Cancer Res,1999,59: 35～43.

　　[6] Shinji K,Daisuke Y,Takeshi F,et al. Promoter methylation of DAL1/4.1B predicts poor prognosis in nonsmall cell lung cancer [J]. Clinical Can,Res.2005,11: 2954～2961.

　　[7] Yu ZH,Wang YC,Chen LB，et al. Analysis of RASSF1A promoter hypermethylation in serum DNA of nonsmall cell lung cancer[J]. Zhong Hua Zhong Liu Za Zhi,2008,30(4):284～287.

　　[8] Grote HJ,Schmiemann V,Kiel S,et al. Aberrant methylation of the adenomatous polyposis coli promoter 1A in bronchial aspirates from patients with suspected lung cancer [J]. Int J Cancer,2004,110(5):751～755.

　　[9] 杨振华,蔡映云,孙丽华. 非小细胞肺癌中hMLH1启动子的甲基化[J]. 肿瘤防治研究，2007,34(1):11～13.

　　[10]Pulling LC,Divine KK,Klinge DM,et al. Promoter hypermethylation of the O6methylguanineDNA methyltransferase gene:more common in lung adenocarcinomas from neversmokers than smokers and associated with tumor progression [J]. Cancer Res，2003，63(16):4842～4848.

　　[11]Shinichiro K,Kenji S,Koji Y, et al. Expression of Ecadherin and ?Catenin in human nonsmall cell lung cancer and the clinical significance[J]. Clin. Cancer Res,2000,6: 4789～4796.

　　[12]Ulivip,Zoli W,Calistri D,et al. p16INK4A and CDH13 hypermethylation in tumor and serum of nonsmall cell lung cancer patients [J]. J Cell Physiol,2006,206(3):611～615.

　　[13]Kurtis E.，Bachman,James G,et al. Methylationassociated silencing of the tissue inhibitor of metalloproteinase3 gene suggests a suppressor role in kidney,brain,and other human cancers[J]. Cancer Res,1999,59: 798～802.

　　[14]刘晓黎，戴洪海，贺美兰，等. 9顺维甲酸对人肺癌组织RARα、RARβ、RXRα转录的影响[J]. 山东大学学报(医学版),2004,42(3):257～260.

　　[15]Vuillemennot BR,Pulling LC,Palmisano WA,et al. Carcinogen exposure differentially modulates RARβ promoter hypermethylation,an early and frequent event in mouse lung carcinogenesis[J]. Carcinogenesis,2004,25(4):623～629.

　　[16]Tamotsu K，Francesco T，Sai Y，et al. Allelic loss on chromosome 3p21.3 and promoter hypermethylation of semaphorin 3B in nonsmall cell lung cancer[J]. Cancer Res，2003，63,3352～3355 .

　　[17]Kim DS,Kim MJ,Lee JY,et al. Aberrant methylation of Ecadherin and Hcadherin genes in nonsmall cell lung cancer and its relation to clinicopathologic features[J]. Cancer, 2007,110(12): 2785～2792.

　　[18]林 勍，陈龙邦，唐永明，等. 非小细胞肺癌患者血清DAPK基因、p16基因甲基化的联合检测[J]. 中国老年学杂志，2006，26(10)：1304～1306.

　　[19]Anglim PP,Galler JS,Koss MN, et al. Identification of a panel of sensitive and specific DNA methylation markers for squamous cell lung cancer[J]. Mol Cancer,2008,7: 62.

　　[20]Cantor JP,Iliopoulos D,Rao AS, et al. Epigenetic modulation of endogenous tumor suppressor expression in lung cancer xenografts suppresses tumorigenicity[J]. Int J Cancer, 2007,120(1): 24～31.

　　[21]Suzuki M,Sunaga N,Shames DS, et al. RNA interferencemediated knockdown of DNA methyltransferase 1 leads to promoter demethylation and gene reexpression in human lung and breast cancer cells[J]. Cancer Res,2004,64(9):3137～3143.