NDRG-1基因在胃腺癌中的表达及与其进展的关系

　　作者：王先福,董米连,陈光,章霞,叶甫波　　作者单位：台州 浙江江省温州医学院第四附属医院(浙江省台州医院)胃肠外科

　　【摘要】目的了解NDRG-1基因在胃腺癌发生发展过程中的作用，并探讨与胃腺癌转移的关系。方法 利用组织芯片，采用Envision免疫组化分析，检测NDRG-1基因在胃正常组织、癌旁组织、胃腺癌组织、 胃腺癌周围淋巴结中有癌细胞转移的淋巴组织和无癌细胞的淋巴结组织中NDRG-1蛋白的表达情况。结果 NDRG-1基因在胃腺癌患者的正常胃组织与胃腺癌组织比较和在有无癌细胞的淋巴结组织之间比较，该蛋白表达均增高，差异有统计学意义(P<0.01);在癌旁组织与胃腺癌组织比较和在胃腺癌原发灶与淋巴结转移灶，该蛋白表达无统计学意义(P>0.05);该蛋白在胃腺癌中的表达与临床病理参数的关系中，与患者的性别、年龄、组织学分级、临床分期、肿瘤的部位以及有无淋巴结转移，其蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)， 但与肿瘤浸润深度、直径大小差异有统计学意义(P<0.01)。结论 NDRG-1基因在胃腺癌的发生发展过程中可能起着促进作用。

　　【关键词】 胃腺癌;转移;NDRG-1;免疫组化

　　胃癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤，其发病率居恶性肿瘤首位，男女发病率为2∶1，病死率为25.21/10万人口，占同期恶性肿瘤死亡总人数的23.26%，每年死于胃癌的人数约16万，随着环境污染的加剧和人口老龄化，发病率和病死率也将逐步增加。但胃癌发病的病因尚未完全明确。大量研究表明，胃癌的发生和发展涉及一个多因素、多基因参与的复杂过程，与细胞的增殖、分化和凋亡的调节密切相关，三者关系的失衡导致肿瘤的发生、发展和转移。

　　NDRG-1(N-Myc downstream regulated gene 1，分化相关基因1)基因作为近年来发现的与细胞分化相关的新基因，其与肿瘤的发生、发展及转移密切相关，且能被多种分化调节剂诱导表达。我们采用免疫组化方法, 观察人在胃腺癌正常组织、癌旁组织、癌组织、有无转移的淋巴结组织中NDRG-1 蛋白表达特点, 探讨它在胃腺癌发展中的分子生物学机制。

　　1 资料与方法

　　1.1 标本来源

　　选取2006年8月至2008年4月，在台州医院就诊, 术前均未接受化学药物治疗或放射线治疗、采用根治性切除手术、临床资料完整的胃腺癌患者83例，其中男性54例，女性29例;年龄43～78岁，中位年龄62岁。所有标本经病理学确诊，并按分化程度分为两组，其中高、中分化腺癌35例，低、未分化腺癌48例;临床分期按WHO国际抗癌联盟(UICC)制定的胃癌分期标准(pTNM)执行，包括Ⅰ-Ⅱ期27例、Ⅲ-Ⅳ期56例;有、无区域淋巴结转移分别是61例和阴性22例;另取距肿瘤边缘>5 cm的正常胃组织(病理确认为正常胃黏膜)和距肿瘤边缘1.5～2.0 cm之间的癌旁组织各15例。所有标本均经10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋、 4 μm 连续切片。

　　1.2 免疫组织化学

　　采用Envision免疫组化分析，鼠抗人NDRG-1单克隆抗体购自美国Santacruz公司，(ndrg-1的稀释比为1:200);免疫组化试剂盒：上海Gene Tech有限公司，主要染色步骤按试剂盒说明进行。

　　1.3 结果判断

　　NDRG-1蛋白阳性信号定位于细胞质或细胞膜，为黄～棕褐色颗粒。请两位病理专家双盲法观察切片，采用半定量积分法判断结果按照阳性细胞所占百分比与着色深浅进行打分：①根据阳性细胞所占百分比评分：阳性细胞数≤5%为0分，6～25%为1分，26～50%为2分，51～75%为3分，>75%为4分。②根据着色强度进行评分：无显色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。取①②项评分的乘积作为染色结果的评判标准：0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(1+)，5～8分为阳性(2+)，9～12分为强阳性(3+)，若两位专家结果相差3分则重新判定。

　　1.4 统计学处理

　　采用SPSS 11.5统计软件进行统计分析，用Wilcoxon秩和检验，Spearman等级相关检验进行分析，以P<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　NDRG 1蛋白阳性信号定位于各组织的细胞质或细胞膜，为黄～棕褐色颗粒，不同部位的组织蛋白表达情况。各组中NDRG-I蛋白表达的阳性率，各组中NDRG-1蛋白表达阳性率的比较。

　　可以看出，NDRG1蛋白在胃腺癌的正常胃组织和胃腺癌组织表达差异具有统计学意义(P<0.01);在无癌细胞转移的淋巴结组织不表达，而在癌细胞转移的淋巴结组织表达为85%，表达差异具有统计学意义(P<0.01);在癌旁组织与胃腺癌组织和在原发灶与淋巴结转移灶的比较，该蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。

　　 NDRG-1蛋白表达与胃腺癌临床病理参数关系

　　可以看出， NDRG-1基因在胃腺癌表达与患者的性别、年龄、组织学分级、临床分期、部位及有无淋巴结转移无统计学意义(P>0.05)。而与肿瘤浸润深度、直径的大小差异有统计学意义(P<0.01)。

　　NDRG-1蛋白阳性信号定位于细胞质或细胞膜，为黄～棕褐色颗粒，在不同组织中的表达情况。

　　3 讨论

　　1997年，荷兰学者Van Belzen[1]首先从结肠癌HT29-D4细胞株体外诱导分化过程中观察到基因表达的变化，并用改良的差异显示法，克隆到一个新的cDNA(Genbank Accession No.X92845)，同时推算出了其编码的氨基酸序列(PIR AccessionNo.CAA63430)，该基因mNRA在结肠上皮细胞分化中上调，在结直肠肿瘤中表达下调，提示该基因与细胞的分化有关，该基因后来被人类基因组组织 (human geneome organization，HUGO)基因命名委员会正式将这些基因统一命名为N-myc下游调节基因(N-myc downstream regulated gene1，NDRG1)。它定位于人染色体8q24.3，长约60 kb,包含16个外显子和15个内含子。该基因具有细胞生长、发育等多种生物学功能，但在肿瘤发展过程中的作用，出现两种相矛盾的结果。贺付成等[2-4]在宫颈鳞癌、乳腺浸润性导管癌、食管鳞癌中与正常相比也呈低表达。关于NDRG-1基因抑制肿瘤生长和转移的分子机制有两点推测[5，6]：①NDRG-1过表达可以诱导E-钙粘连素和其他细胞分化标记物的表达，这些细胞表面分子的改变可能改变肿瘤细胞之间的粘附特性，从而抑制体内外肿瘤细胞的侵袭能力。②NDRG1过表达可以显著减少血管生成因子的表达，如血管内皮生长因子(VEGF)、金属蛋白9(MMP-9)和白介素8(IL-8)。从而抑制血管生成，而血管生成是肿瘤生长和转移的关键因素。所以推测NDRG1通过调节肿瘤细胞及其周围组织的血管生成来抑制肿瘤的生长和转移。

　　但Cangul等[7]用免疫组化方法观察到NDRG-1基因在正常组织中呈低水平表达，但在多种肿瘤组织如肺癌、脑肿瘤、恶性黑色素瘤、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、肾癌、子宫内膜癌、肝癌、结直肠癌呈高表达。王震等[8]的研究发现，NDRG-1 基因在正常大肠黏膜组织-大肠腺瘤-无淋巴结转移的大肠癌-有淋巴结转移的大肠癌的发生发展过程中,其蛋白表达逐渐增高,差异有统计学意义，提示在肿瘤的发生、发展及转移的过程中，NDRG-1起着促进作用。关于NDRG1促进肿瘤生长和转移的分子机制通过以下两条途径[9]：①通过HIF-la依赖的途径，缺氧造成HIF-1转录因子的活化及表达，最后诱导缺氧敏感基因NDRG-1的表达;②通过非HIF-1依赖的途径。实验证实缺氧条件下细胞内Ca2+内流增加也可以诱导NDRGI表达，其分子机制主要是Ca2+内流增加诱导c-Jun的表达，活化aetivatorproteinl(AP-1)依赖的转录。所以，HIF-1与c-Jun/AP-1依赖的途径共同参与调节缺氧诱导基因NDRGI在肿瘤组织中的表达。

　　在本实验中观察到，在无癌细胞转移的淋巴结组织蛋白不表达，而在有癌细胞转移的淋巴结组织蛋白表达率为85%，且差异均具有统计学意义(P<0.05);在肿瘤浸润深度、直径大小上有统计学意义(P<0.01)。因此，可以认为NDRG-1基因在胃癌进展中，可作为促进转移一个候选的基因，并可望成为早期预测胃腺癌转移的分子生物学标记物之一。

　　【参考文献】

　　[1]van Belzen N，Dinjens WN，Diesveld MP，et al.A novel gene which isUp regulated during colon epithelial cell differentiation and down regulated in colorectal neoplasms. Lab Invest，1997,77:85-92.

　　[2]贺付成，张岚，高冬玲，等.食管鳞癌组织中NDRG1mRNA和蛋白的表达.郑州大学学报(医学版)，2006,41(3)：395-398.

　　[3]马少飞，陈嘉薇，祝峰，等.NDRG1基因与宫颈鳞癌发生发展及转移的关系.肿瘤，2008，28(3)：238-241.

　　[4]左晓明，姚晓虹.NDRG1在乳腺浸润性导管癌中的表达及其与侵袭转移的关系.上海交通大学学报，2007，27(12)：1498-1500.

　　[5]Wang Z,Liu Q,Chen Q,et al.Overexpression of NDRG1:relationship with proliferation activity and invasiveness of breast cancer cell line and breast cancer metastasis.Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi，2006，35(6)：333-338.

　　[6]Maruyama Y,Ono M，et al.Tumor growth suppression in pancreatic cancer by a putative metastasis suppressor gene Cap43/NDRG1/Drg-1 through modulation of angiogenesis.Cancer Res，2006，66(12)：6233-6242.

　　[7]Caruso RP,Levinson B,Melamed J,et al.Altered N-myc downstream-regulated gene 1 protein expression in African-American compared with caucasian prostate cancer patients.Clin Cancer Res，2004，10(1 ):222-227.

　　[8]王震,王芳,魏万里,等. NDRG-1基因在结直肠癌发生发展过程中的表达及其与淋巴结转移的关系.中华病理学杂志,2004，33(3)：264-265.

　　[9]Salnikow K,Kluz T,Costa M,et al.The regulation of hypoxic genes by calcium involves c-Jun/AP-1,which cooperates with hypoxia-inducible factor 1 in response to hypoxia.Mol Cell Biol，2002，22(6)：1734-1741.