MDP阿霉素脂质体对裸鼠SOSPM成骨肉瘤肺转移的治疗

　　作者：屈小鹏，吴道澄，陈军，张殿忠，卫建民，吴红，马保安 作者单位：第四军医大学： 1唐都医院全军骨肿瘤研究所，陕西 西安 710038， 2化学教研室， 陕西 西安 710033

　　【摘要】 　　目的： 建立人成骨肉瘤高转移细胞亚群SOSPM裸鼠肺转移模型，用亚锡亚甲基二磷酸盐阿霉素脂质体(MDPLADM)进行治疗并观察其疗效. 方法： 建立SOSPM成骨肉瘤裸鼠肺转移模型，制备MDPLADM，经尾静脉注入裸鼠体内，观察其抑瘤作用. 应用高效液相色谱法检测裸鼠肺内阿霉素(ADM)的含量. 结果： MDPLADM对裸鼠肺转移模型具有明显的抑瘤作用，其抑瘤率为40.0%(P<0.05). 肺湿质量的减轻率为21.6%(P<0.05). 裸鼠肺内ADM含量MDPLADM组高于LADM组(P<0.05)和ADM组(P<0.05). 结论： MDPLADM能明显提高ADM对SOSPM成骨肉瘤裸鼠肺转移模型的抑瘤作用.

　　【关键词】 多柔比星，脂质体，骨肉瘤，肺肿瘤继发性，抗肿瘤药

　　Treatment of pulmonary metastasis in nude mice carrying human SOSPM osteosarcoma with adriamycin liposome conjugated with MDP

　　QU XiaoPeng1, WU DaoCheng2, CHEN Jun1, ZHANG DianZhong1, WEI JianMin1, WU Hong2, MA BaoAn1

　　1Chinase PLA Institute of Orthopedic Oncology, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710038, 2Department of Chemistry, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China

　　【Abstract】 AIM: To observe the therapeutic efficacy of MDPliposome adriamycin on the pulmonary metastatic model in nude mice carrying human SOSPM osteosarcoma. METHODS: The pulmonary metastatic model was made in nude mice carrying human SOSPM osteosarcoma. MDPliposome adriamycin was prepared. The antitumor effect of MDPliposome adriamycin was observed and the content of adriamycin in lungs was determined by highperformance liquid chromatography with luorescence detector. RESULTS: MDPliposome adriamycin exerted obvious antitumor effect on the animal models, with the inhibition rate as 40% (P<0.05), and the reduction rate of lung wet weight was 21.6% (P<0.05). The content of adriamycin in lungs was higher in MDPliposome adriamycin group than in adriamycin liposome group (P<0.05) and adriamycin group (P<0.05). CONCLUSION: MDPliposome adriamycin improves the antitumor effect of adriamycin for the pulmonary metastasis in nude mice carrying human SOSPM osteosarcoma.

　　【Keywords】doxorubicin; liposomes; osteosarcoma; lung neoplasms/secondary; antineoplastic agents

　　0引言

　　肺转移是骨肿瘤患者死亡的主要原因之一，目前对其的主要治疗是手术加化疗[1]. 阿霉素(adriamycin, ADM)是有效抗肿瘤药物，其脂质体对于网状内皮系统的治疗效果已得到证实，但其靶向治疗在临床实际应用上具有局限性. 亚锡亚甲基二磷酸盐(methylene diphosphonate, MDP)是一种亲骨性药物，与阿霉素脂质体(liposome adriamycin, LADM)交联后通过改变其在体内的药代动力学分布，可提高骨肿瘤的抗瘤效果. 我们观察MDPLADM对SOSPM成骨肉瘤裸鼠肺转移模型的治疗作用，为临床骨肿瘤肺转移治疗提供理论和实验依据.

　　1材料和方法

　　1.1材料Balb/cun/un裸小鼠60只(购自第四军医大学实验动物中心)，鼠龄4~6 wk，体质量15~18 g，雌雄各半，在SPF环境下饲养，试验前检疫观察，生长良好. 人成骨肉瘤高转移细胞亚群SOSPM由本实验室建立，其肺转移率为100%[2-3]，在含100 mL/L小牛血清的RPMI1640完全培养液中37℃ CO2孵箱培养. 盐酸ADM和ADM标准品均购自浙江海正药业股份有限公司;MDP购自江苏原子医学研究所;倒置及透射显微镜均由日本Olympus公司制造;Shimadzu LC6H型高效液相色谱系统，配RF紫外检测器，CR3A数据处理仪，均购自日本岛津公司.

　　1.2方法采用常规细胞培养方法，复苏SOSPM细胞，取对数生长期细胞，经25 g/L胰酶消化后制成细胞悬液，由尾静脉注入裸鼠体内，每只注射0.2 mL(2.5×109/mL细胞密度). 2 wk后重复注射1次. 6 wk后挑选出确有肺转移的裸鼠55只，用高效液相色谱法检测其中9只肺内ADM含量，其余46只裸鼠随机分为5组： MDPLADM组，LADM组，游离ADM组，MDP组和生理盐水组(对照组)，各组裸鼠数分别为9，10，8，10和9只. 各组裸鼠均由尾静脉给药. MDPLADM组, LADM组和ADM组均按5 mg/kg给予ADM, MDP组按2.5 mg/kg给予MDP，对照组按5 mg/kg给于生理盐水，每隔72 h治疗1次，共治疗3次. 治疗9 d后脱臼处死裸鼠，750 mL/L乙醇消毒，摘取双肺. 将9只行高效液相色谱法检测的裸鼠随机分为ADM组，LADM组和MDPLADM3组，每组3只，给药量及治疗方式同前. 治疗后9 d处死裸鼠，取出双肺，电子天平称质量，置5倍放大镜下见转移灶者计双肺表面结节数，计算抑瘤率R(%)=[(1-对照组结节数/治疗组结节数)×100%]. 100 g/L甲醛溶液固定，脱水后石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下进行组织形态学观察. 完整提取肺脏后加磷酸盐缓冲液(pH=7.8)2.0 mL，用超生组织匀浆机以6000 r/min匀浆. 再加氯仿甲醇混合液(4∶1)5 mL，在液体快速混合器上旋振5 min，3000 r/min离心10 min. 取氯仿层，37℃氮气吹干. 残渣用甲醇100 μL溶解，微量过滤器过滤后进样40 μL，测定肺组织标准色谱图，比较各组肺内ADM含量.

　　统计学处理： 采用单因素方差分析与两两比较对各组数据进行处理，MDPLADM与游离ADM两组间用t检验. 高效液相色谱法检测三组裸鼠肺内ADM含量后，检测值以MCPKP程序采用非线性最小二乘法自动拟合求得.

　　2结果

　　2.1MDPLADM对裸鼠肺转移瘤的抑制作用各组裸鼠肺转移结节数目和大小不同，最大有黄豆粒大，最小需借助5倍显微镜观察. 其中MDPLADM组肺转移结节最少且小，其抑瘤率为40.0%;LADM组与游离ADM组抑瘤率分别为31.7%和16.0%. 前者与后者相比较差异具有统计学意义. MDPLADM组肺湿重减轻率为21.6%(P=0.024)，肺湿重减轻率LADM组及游离ADM组分别为14.3%和7.4%，前者与后者相比差异具有统计学意义(P<0.05，表 1).

　　2.2组织形态学生理盐水对照组肿瘤细胞生长活跃，呈圆形或卵圆形，排列紧密，核大深染数目增多，偶见瘤巨细胞，核膜清晰，核浆比例倒置. 肺泡壁增厚，有充血和渗出，肺泡结构破坏血管淤血，并可见散在大小不等的转移肿瘤细胞团块，团块胞膜清晰与肺组织界线清楚(图1)，转移瘤切片可见软骨细胞. MDP组肺部变化和肿瘤细胞生长情况与生理盐水组无明显区别. 游离ADM组部分肿瘤细胞结构模糊，部分核溶解，可见核膜收缩. MDPLADM组肺组织小部分结构破坏，血管淤血及肺泡壁增厚，肿瘤细胞团块区呈大片状嗜酸性坏死(图2). 表1MDPLADM对裸鼠肺转移瘤的抑瘤作用和肺湿重的减轻率

　　2.3裸鼠肺内ADM的含量以Y为ADM与外标峰面积之比，以X为ADM的浓度，采用外标法求得肺组织中ADM的回归方程为：Y=1.982X-0.476 (r=0.998, n=3). 肺组织中ADM浓度在0.03~4.20 mg/L，范围内线性良好. 在S/N=3时，求得ADM的最低检出浓度为15 μg/L，肺组织中ADM平均回收率为98.6%，RSD为3.1%.

　　3讨论

　　骨肉瘤是恶性程度很高的肿瘤，肺转移是其死亡的主要原因之一. 过去多采用预防性肺部放疗以预防肺转移. 近20余年来随着大剂量化疗的应用、免疫治疗的进步和外科技术的日益成熟及推广，成骨肉瘤的治疗取得了很大进展[4]. 骨肉瘤肺转移灶采用手术切除并辅以化疗，使无瘤成活率明显提高，国外已有5 a成活率达70%的报道. 国内也有学者认为手术+化疗可能使肺转移患者有机会获得根治. 但化疗药物在体内分布广泛，缺乏对肿瘤组织的靶向性，在杀伤肿瘤细胞的同时也伤害宿主正常细胞，产生明显毒副反应. ADM抗瘤谱广、疗效好，可治疗多种肿瘤，也是最先被普遍认为具有抗骨肉瘤活性的药物[5]. 但在临床应用中易出现严重的心肌损害、骨髓抑制等副作用. 为了明显减轻化疗药物的毒副作用，增加化疗药物抗肿瘤的疗效，近年来国内外在利用药物导向治疗来减轻药物毒副作用方面进行了一系列的研究. 目前研究较为成熟的脂质体，能明显降低化疗药物的毒副作用，增加抗瘤疗效，已在临床上应用[6].

　　Vaage等[7]用聚乙烯乙二醇脂质体ADM与游离ADM治疗人腺管肉瘤(AsP1)移植物裸鼠的研究表明，其肿瘤部位的ADM浓度，聚乙烯乙二醇脂质体比游离ADM组高出6倍以上，并显示出明显的抑瘤效果，裸鼠的存活期明显延长. 文艺等[8]用MDPLADM与游离ADM对照治疗但由于脂质体对于网状内皮系统的肿瘤具有靶向性以及其本身的胶体结构性质，限制了脂质体对非网状内皮系统肿瘤(如骨肿瘤、胃癌等)的靶向性和疗效，由此引出MDPLADM治疗骨肿瘤,以mAb为“导向弹头”治疗胃癌等一系列特异性LADM. 特异性脂质体的开发，使脂质体具有明显的缓释和控释作用以及良好的定向疗效. 肿瘤药物脂质体治疗骨肿瘤肺转移国内外未见报道. 我们利用MDP的天然亲骨性，将其与LADM直接交联，制备成亲骨性的MDPLADM，用于对人成骨肉瘤裸鼠肺转移模型的治疗，结果表明MDPLADM对人成骨肉瘤裸鼠肺转移瘤具有明显的抑瘤作用，其抑瘤作用强于LADM组(P<0.05)及游离ADM组(P<0.05);肺湿重的减轻率低于LADM组(P<0.05)及游离ADM组(P<0.05).

　　综上所述，MDPLADM应用于人SOSPM成骨肉瘤裸鼠肺转移瘤的治疗，具有明确的靶向抗瘤作用，为临床骨性恶性肿瘤的肺转移治疗提供了理论和实验依据.

　　【参考文献】

　　[1] 陆裕朴，胥少汀，葛宝丰，等. 实用骨科学[M]. 北京：人民军医出版社, 1991: 1477.

　　[2] 杨宁，范清宇，殷剑宁，等. 完整瘤组织块原位移植法建立人成骨肉瘤转移模型[J]. 癌症, 2000, 19: 843-846.

　　[3] 殷剑宁，范清宇，龙华，等. 高转移性人成骨肉瘤细胞亚群的筛选及生物学特性的观察[J]. 中华骨科杂志, 1999,19(7): 437-440.

　　[4] 郭卫，李大森，沈丹华，等. 多中心成骨肉瘤的治疗[J]. 中华骨科杂志, 2006, 26(6): 376-380.

　　[5] Tunn PU, Reichardt P. Chemotherapy for osteosarcoma without highdose methotrexate: A 12year followup on 53 patients[J]. Onkologie, 2007, 30(5):228-232.

　　[6] Hoving S, Seynhaeve AL, van Tiel ST, et al. Addition of lowdose tumor necrosis factoralpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved antitumor activity in osteosarcomabearing rats[J]. Anticancer Drugs, 2005, 16(6):667-674.

　　[7] Vaage J, Donovan D, Uster P. Tumor uptake of doxorubicin in ployethylene glycolcoated liposomes and therapeutic effect against a xenografted human pancreatic carcinoma[J]. Br J Cancer, 1997,75(4): 482-486.

　　[8]文艺，马保安，吴道澄，等. MDP阿霉素脂质体的制备及其对大鼠成骨肉瘤的抗瘤作用[J]. 第四军医大学学报, 1999, 20(12): 120-122.