肺癌干细胞研究进展

　　作者：王树岗， 曾志勇 作者单位：福建医科大学福总临床医学院，南京军区福州总医院心胸外科，福州 350001

　　【关键词】 肺肿瘤，干细胞，肿瘤干细胞，肿瘤细胞

　　肺癌干细胞研究进展肺癌是当前危害人类生命和健康最严重的恶性肿瘤。据报道，经手术、放化疗等治疗后5年存活率不足15%[1]。随着环境污染的日益加重，1950年代后发病率迅速上升，目前在男性恶性肿瘤中占第一位，女性的发病率也在不断增长，占恶性肿瘤的第二位[2]。肿瘤干细胞(tumor stem cell, TSC)是当前研究的热点，人们希望从肺癌干细胞的角度找到根治肺癌的途径，近年来对肺癌干细胞的研究已经取得了很大进展，笔者就肺癌干细胞的分离、鉴定方法等最新研究进展综述如下。

　　1 肿瘤干细胞

　　肿瘤发病率居高不下，但目前肿瘤治疗效果却远不能令人满意，造成这一结果的主要原因在于肿瘤的发病机理至今仍不明确。人们发现肿瘤细胞与干细胞在自我更新、信号传导、耐化疗药物等方面有许多相似之处，人们就二者之间的相似性提出了TSC学说，认为主导肿瘤发生发展、转移复发的关键细胞是TSC[3]。

　　TSC的最早报道见于白血病。Dick等发现大多数急性粒细胞性白血病中只有CD34+、CD38-细胞能在NOD/SCID小鼠骨髓中形成白血病细胞克隆，而CD34+、CD38+和CD34-细胞则未能形成克隆[4]。由于血液细胞起源于造血干细胞，故与其他实体组织相比具有一定的特殊性。近年来，随着干细胞表面抗原的研究发展，实体TSC的研究也取得了较大发展。

　　AiHajj等研究后发现，所有接种ESA+、CD44+、CD24-、Lin-乳腺癌细胞的小鼠在12周内均出现明显的肿瘤，而接种CD44-或CD24+细胞的小鼠则少有肿瘤生长。ESA+、CD44+、CD24-、Lin-细胞遂被称为乳腺癌干细胞，首次证明了在实体瘤中同样有TSC的存在[5]。Singh等报道，在脑肿瘤中分离出了TSC，但与乳腺癌干细胞不同的是，脑TSC的分离是以CD133为干细胞膜蛋白标记的[6]。2006年，O'brien等在研究结肠癌时将CD133+细胞接种于NOD/SCID鼠肾被囊中，以鉴定结肠癌起始细胞。发现CD133+结肠癌细胞可以起始肿瘤，因此认为CD133+细胞就是结肠TSC[7]。迄今为止，已成功分离并鉴定的实体TSC还包括前列腺癌、黑色素瘤及胰腺癌等[810]，肺癌TSC的研究也取得了巨大进展。其他肿瘤，如胃癌中是否存在TSC目前尚不清楚[11]。

　　2 肺癌干细胞

　　2.1 研究进展

　　2005年，Kim等从小鼠支气管肺泡导管连接处分离出一群Sca+CD45-Pecam-CD34+细胞，命名为支气管肺泡干细胞(bronchioalveolar stem cells, BASCS)。研究发现，BASCS在支气管、肺泡损伤和上皮细胞体内修复更新时发挥作用，当体内支气管和肺泡损伤时发生增殖;BASCS能够分化为终末细支气管上皮细胞 (Clara细胞)、I型肺泡上皮细胞(AT I细胞)和Ⅱ型肺泡上皮细胞(ATⅡ细胞)，表明其具有自我更新和多向分化潜能，故认为鼠肺末梢支气管癌的发生和BASCS有关[12]。这个结果为人肺TSC的研究提供了一个重要线索。

　　2006年，黄盛东等将A549单细胞悬液接种到96孔板，观察其克隆形成率、克隆形态及传代情况。结果发现，A549细胞可形成3种类型的克隆集落，其中Holoelone型占总克隆数的4%，克隆体积大，可连续传代20次以上，并可分化为其他2种类型的集落，增殖活性不随时间延长而降低，并表达Sca1+等干细胞标记[13]。2007年，Summer等利用干细胞排斥Hoechst染料的特性，并结合CD45、CD31成功从鼠的肺组织中分离出肺内源的间充质干细胞[14]。同年，Ho等对6种人肺癌细胞株的侧群(side population,SP)细胞进行了一系列实验研究，发现肺癌SP细胞较非SP细胞具有更强的致瘤性，同时人端粒末端转移酶表达增高，说明这部分SP细胞具有TSC特性。同时发现肺癌SP细胞表达乳腺癌耐药蛋白(ABCG2)等多种ATPbinding cassette(ABC)家族膜转运蛋白是其对化疗药物不敏感的主要原因[15]。2008年，国外学者从A549中分离出有干细胞特性的SP细胞，这些SP细胞在总细胞群里约占24%。在增殖实验中，发现SP和非SP细胞均可形成含SP和非SP细胞的异质细胞群落，但SP较非SP细胞增殖的速度明显提高，而且SP较非SP细胞更高表达ABCG2，有更强的抗凋亡能力，从而认为A549中的SP细胞具有干细胞特性[16]。同年，Eramo等报道了肺癌干细胞属于CD133+细胞亚群，他们发现在肺癌中存在小部分表达CD133的未分化细胞，这些CD133+细胞可在无血清培养基中以球体的形式生长，在免疫缺陷小鼠体内注射104个细胞即可很容易的使之产生与原细胞相同性质的肿瘤，认为CD133+细胞拥有TSC特性[17]。

　　董强刚等采用流式细胞及RTPCR技术检测肺癌细胞株中干细胞相关标志表达，并通过裸鼠移植评估其致瘤性，结果在A549和SPCA肺腺癌细胞株中发现一个新颖的癌细胞亚群，其表型特征为CD24+IGF-1R+，具有高侵袭性和高致瘤性并具有自主生长特性，能够在无血清条件下长期培养，认为其是肺腺癌干细胞[18]。2009年，Tirino等对89例非小细胞肺癌(NSCLC)患者的活体肿瘤组织进行研究，发现89例中有72%表达CD133，其平均表达值为6%，CD133+肺癌细胞在其后的实验中表现了更强的致瘤能力[19]。同年，文加斌等对NCIH446人小细胞肺癌(SCLC)细胞株的干细胞特性进行研究，结果15个单细胞克隆生长形成克隆，形态上大致分为2种克隆，实验说明人SCLC细胞株存在异质性肿瘤细胞克隆，可能来源于TSC的分化[20]。

　　国外的研究对象较为笼统，如Tirino对NSCLC进行了干细胞方面的研究，Eramo的研究对象包括所有肺癌，但均未针对肺腺癌、鳞癌等具体组织学分型进行细分研究[17，19]。鉴于不同肺癌类型生物学特性的巨大区别，未来还需在不同肺癌组织学分型上进行深入研究。国内对肺癌干细胞的研究虽有很大进展，但同样有其不足之处。国内研究仅停留在体外培养的肺癌细胞株水平，未对活体的新鲜肺癌细胞进行深入研究，而肺癌细胞在体内、体外环境中的生物学特性肯定是有区别的，要使肺癌干细胞理论有效指导临床工作，就必须在体内培养的肺癌细胞领域进行突破。

　　2.2 肺癌干细胞的分选方法

　　肺癌干细胞的分选主要采用两种方法，一种是应用细胞表面特异性标记进行分选，另一种是根据SP表型进行TSC的分选。

　　应用细胞表面特异性标记分选使用的主要仪器有两种，即荧光激活细胞分选(fluorescence activated cell sorting，FACS)和磁性激活细胞分选(magnetic activated cell sorting，MACS)。FACS是利用干细胞表面一些膜蛋白，主要是一些CD抗原表达上调和下调的特点，用流式细胞仪分选干细胞，如董强刚等即是采用FACS对A549和SPCA肺腺癌细胞株进行了TSC的研究[18]。MACS则是利用未标记的CD抗原等蛋白的单克隆抗体作为第一抗体与单细胞悬液结合，再用免疫磁珠标记的第二抗体与之结合，利用这种特异性一抗、二抗标记的细胞悬液流过特制的磁场，经柱内洗脱收集干细胞。人们发现造血干细胞具有将荧光染料泵出细胞外的特性，即SP特性[21]。目前利用这一特性进行纯化已成为一种常用的分离方法。如Ho等对6种人肺癌细胞株中提取的SP细胞研究后发现其具有TSC特性[15]。SP细胞表面表达ABCG2等ABC家族膜转运蛋白，因此，同样可以应用ABCG2作为标记分选TSC。

　　2.3 肺癌干细胞的鉴别方法

　　TSC的定义是肿瘤组织中存在的极少量具有自我更新、无限增殖和多向分化潜能的肿瘤细胞。目前研究认为TSC是一个功能学概念，所以其功能测定有重要意义，单纯利用TSC共有标记物得到的细胞还不能被认为是TSC，必须通过一些经典的干细胞实验进行检验。自我更新是干细胞的三大重要特性之一，是指干细胞进行细胞分裂时，其所产生的后代中至少有一个保持与亲代细胞完全相同的性状，而另一个可以定向分化增殖，即不对称性分裂方式。某些细胞如CD133+肺癌细胞能够在含多种生长因子的无血清培养基内以细胞球的方式悬浮生长，这是鉴定其是否具有自我更新能力的重要步骤，也是鉴定其是否为TSC的重要方法[17]。

　　致瘤能力是鉴定TSC的最重要环节，目前一般通过裸鼠致瘤实验进行检验，通常做法是将分选的细胞接种于免疫缺陷动物体内，观察其在一定时间内形成移植瘤的情况(如成瘤时间、肿瘤大小等)[22]。目前已经鉴定的TSC均进行了此实验，比如Eramo和Tirino对肺癌干细胞的研究[17，19]。分化潜能也是TSC的重要特征之一。从细胞分化角度来看，从干细胞到成熟细胞要经过全能干细胞、多能干细胞、定向祖细胞、组织特异性干细胞直至终末分化细胞。TSC分化的最终结果也至少会有一种分化细胞，实验中可通过单克隆实验进行检验，以此鉴定其干细胞特性。如黄盛东等对A549细胞株中Holoelone群落的研究[13]。

　　3 肺癌干细胞研究的临床意义及展望

　　肿瘤困扰人类的健康已有上千年的历史，其原因可能是现有的治疗主要针对肿瘤组织内的大多数细胞，并没有将那些数量很少但对肿瘤的发生发展、转移复发起决定作用的TSC杀死，即使肿瘤组织消失了，但经过一段时间后仍可以重新形成肿瘤。TSC学说是当前肿瘤研究的前沿，它为肿瘤研究开辟了一个新的视野，这将彻底的颠覆肿瘤的既往治疗策略。在未来的肿瘤治疗中，应该强调针对TSC的治疗，力求将TSC全部清除。

　　目前肺癌的主要治疗方法即手术加放化疗，但肺癌干细胞比普通肺癌细胞更能耐受放化疗，它的残留是肿瘤复发的根源，寻找更为有效的治疗方法已经是目前的迫切要求。随着干细胞研究技术和应用水平的不断进步，提取和纯化TSC建立细胞库已经成为可能，肺癌干细胞的研究不但有助于了解肺癌的发生发展、复发转移，同时可能对肺癌的临床诊断及治疗带来重大突破。

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