血管生成调控因子与肿瘤生长及治疗的研究进展血管生成调控因子与肿瘤生长及治疗的研究进展

　　作者：王璇 侯建青 作者单位：(青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院妇产科，山东 烟台 264000)

　　【关键词】 肿瘤，血管生成，调控，抗血管生成治疗

　　1968年Tannock IF发现肿瘤细胞分裂速率的减慢与营养血管的距离增大相关，肿瘤的氧气和营养供应限制了肿瘤生长。20世纪70年代，美国学者Folkman提出了肿瘤生长是依赖血管的。这为靶向血管的抗肿瘤研究奠定了坚实的基础。大量的研究结果证实，肿瘤的发生、发展、侵袭以及转移与其所诱发的新生血管密切相关。肿瘤血管生成是一个极其复杂的过程，这个过程受血管生成因子的正调控和负调控，当正调控因素增加或负调控因素减弱时，将促进肿瘤的生长与转移，反之抑制肿瘤的生长与转移。随着血管发生机制研究的不断深入，抗血管生成疗法在肿瘤综合治疗当中越来越显示出良好的应用前景。本文就血管发生的调控因素及治疗进展阐述如下。

　　1 肿瘤血管生成的机制、特点

　　实体肿瘤生长必须依赖持续和广泛的血管生成。血管生成为肿瘤组织提供营养物质和氧气，血管又是发生转移的主要途径。而肿瘤血管生成又与血管形成相关因子的调节密切相关，所以研究血管生成调节因子与肿瘤的关系有着重要的理论意义和临床价值。随着不断增多的血管生成调节因子的发现，为肿瘤的诊断、分期、判断治疗反应和预后提供了新的参数指标。针对血管形成的某些因子及其关键步骤进行干预，可切断肿瘤血供及其转移途径。对肿瘤的治疗和防止肿瘤远处转移有重要意义。

　　血管生成过程包括内皮细胞(Endotheliocyte)趋化、移动、增殖、管腔结构的形成及血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cell)等血管周围细胞的移入、黏附至内皮层进而形成完整的血管壁，再经重塑形成成熟的血管系统等〔1〕。血管生成有两种方式：①发芽性血管生成，即内皮细胞降解细胞外基质，并通过趋化移动、增殖，形成新的管腔。②非发芽性血管生成，是已存在的血管通过分裂的方式或相邻血管通过融合成为新的血管。肿瘤诱发血管生成特有的特点：当肿瘤直径≤3 mm时，肿瘤细胞间通过弥散作用取得营养，此时不产生血管生长因子，且很少发生转移。当肿瘤直径>3 mm时，必须需要新生血管来提供充足的血液，此时肿瘤诱导巨噬细胞产生血管生长因子，从而使内皮细胞分裂加快，血管增生，肿瘤得以长大。但当肿瘤组织新生血管被阻断时，即使是巨大的肿瘤也会被抑制，新近提出的肿瘤休眠疗法(tumor dormancy therapy)即是依据血管生成促进因子与抑制因子的动力学平衡学说提出的〔1〕，因此抗血管生成在肿瘤的治疗中已成为引人注目的靶点。

　　2 肿瘤血管生成的调控

　　肿瘤血管形成的调控分为正调控和负调控〔2〕，当正调控因素增加或负调控因素减弱时，将促进肿瘤的生长与转移，反之抑制肿瘤的生长与转移。其中促血管内皮生长因子的分泌产物激活的巨噬细胞可影响血管生成的周围基质的分解、内皮细胞增殖、细胞索的形成及管道的开通等各个阶段〔3〕。

　　2.1 正调控因素主要包括血管生成因子等直接诱导剂及间接诱导剂，现重点介绍如下：

　　2.1.1 血管内皮生长因子(VEGF) 作用最强大，具有旁分泌和自分泌的功能，是目前所知道的最强的直接作用于血管内皮细胞的生长因子，可作为肿瘤代谢和转移的标志〔4〕。VEGF促血管生成作用是通过蛋白激酶C(PKC)通路传递信号的，当VEGF经旁分泌途径与细胞膜上的特异受体结合时，激活胞膜的靶分子磷脂酶CP(PLCr)，PLCr促进磷脂酰肌醇4，5二磷酸(PIP2)水解，使内质网上的Ca2+通道开放并向胞浆释放Ca2+，进一步激活PKC〔5，6〕，发挥其生物学功能。调节VEGF的因素很多:①缺氧诱导因子(hypoxiainducible factor,HIF1)在基因水平上直接调控VEGF的表达，是恶性肿瘤诱导新生血管形成的一个主要调控因子〔7〕。HIF1是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子，它能与VEGF5′端增强子TACGTGGG(975)DNA序列结合增强VEGF的转录。当在缺氧条件下与TGFβ、Smad3同时存在时，有协同加强VEGF转录水平表达的作用〔8，9〕。HIF亦可激活转铁蛋白、内皮素1、iNOS基因的表达，而这些产物在肿瘤的血管扩张、新血管形成及肿瘤转移中起重要作用〔10〕;②近年来大量研究表明，环氧化酶(cyclooxygenase，COX)在多种肿瘤中有较高表达，并认为参与了肿瘤新生血管的生成。有资料证实，COX2主要是通过上调VEGF表达起作用，抑制COX2则可下调VEGF的表达〔11〕;③细胞因子TNFα、IL1β和IFNα，各种转化生长因子、表皮生长因子、IL6、IL12及一些癌基因如突变的ras基因和p53基因均通过上调VEGF产生促血管活性〔12〕，故VEGF可能为各种促血管活性因子的最后共同通路。

　　2.1.2 碱性、酸性成纤维细胞生长因子 碱性成纤维细胞生长因子在体外具有强力的VEGF协同促毛细血管生长作用，为强大的内皮细胞分裂原。毛细血管内皮细胞、肿瘤细胞及浸润到肿瘤组织内的淋巴和巨噬细胞可以分泌碱性成纤维细胞生长因子，与肿瘤预后明显有关。酸性成纤维细胞生长因子是一种肝素结合部位特异性内皮细胞分裂素，在正常细胞和肿瘤细胞均有表达，可被血管生成抑制基因所阻止。

　　2.1.3 黏附因子 血管生成过程中需要EC与细胞外基质间、EC与EC间及EC与其他周围细胞间的相互作用，这种作用是由黏附因子完成的。Ruegg等〔13〕发现TNF、γIFN可以通过抑制αγβ3整合素活性来抑制恶性黑素瘤的血管生成。VECadherin是存在于EC间的黏附分子，对已形成管状结构的EC加入VECadherin.mAb后可以破坏其结构〔14〕。

　　2.1.4 表皮生长因子(Epidermical Growth Factor)、转化生长因子(TGF)、肝细胞生长因子(HGF) EGF是一种多肽生长因子，对血管内皮细胞、上皮细胞及许多其他细胞具有促有丝分裂作用。TGF是稳定的具有多种功能的多肽生长因子。其中，TGFβ由巨噬细胞和激活的血小板产生，在体外有巨噬细胞趋化性，近来发现它可以促进血管生长，但其作用为剂量依赖性，低浓度刺激血管生成，高浓度时则抑制血管生成。HGF是由基底膜细胞分泌的一种蛋白质，能破坏细胞连接，并刺激癌细胞向外浸润，同时诱导肿瘤新生血管生长。

　　2.1.5 血小板诱导的内皮细胞生长因子、PTN(Pleiotrophin) 血小板诱导的内皮细胞生长因子不仅与肿瘤血管生成有关，还与肿瘤转移有关。体外实验证实血小板诱导的内皮细胞生长因子是一个血管诱导剂且伴随蛋白酶解活动，这是肿瘤转移过程中所必须的。现证实PTN存在于所有的肿瘤组织中，并具促血管生成活性〔15〕。

　　2.1.6 其他 血管生成素(Angiopoietins，AP)/Tie2是一种新发现的调节血管生成的重要信息途径。AP1促进内皮细胞受体Tie2磷酸化，吸引血管平滑肌细胞、周细胞等血管周围细胞包围，支持内皮细胞，促进血管重塑、成熟，维持血管的完整性和调节血管功能〔16〕。AP2竞争抑制AP1的作用，在VEGF等促血管生成因子存在时促进血管生成;当缺乏血管生成因子时，AP2则参与新生血管的消退过程;内皮细胞的另一酪氨酸激酶受体EphB4(属于Eph受体家族，由静脉内皮细胞产生)，与其配体EphinB2(由动脉内皮细胞产生)对血管生成也起重要作用。VEGF促使形成基本的毛细血管丛，而EphinB2和AP是新生血管重建所必需的。有作者在大鼠角膜血管生成模型中抗血管生成素2治疗也阻断了血管内皮细胞生长因子刺激的新生血管生成。这些结果暗示了特异血管生成素2抑制对于实体肿瘤病人的治疗是一种有效的抗血管治疗策略。证明了抑制血管生成素2可抑制肿瘤生长和血管生成〔17〕。促血管生成素(angiopoietin，Ang)是新近才发现的一族蛋白分子，包括Ang1、Ang2、Ang3、Ang4四种分子〔18，19〕。Ang作用于内皮特异的Tie2受体，维持成熟血管的完整性及静息状态，并参与生理及病理情况下如月经周期、伤口愈合等的血管新生。近年发现，Ang在肿瘤血管新生中作用显著。在多种癌组织如胶质细胞瘤、星型细胞瘤、甲状腺癌等均见到有Ang及其受体表达增加，特别是在肿瘤边缘的新生血管区。目前研究认为，Ang1的表达与肿瘤血管形成的多少关系不大;而Ang2表达是肿瘤血管新生起始及加强的因素，与肿瘤血管形成数目、临床分期、预后关系密切。

　　2.2 负调控因素 主要包括：①肿瘤抑制基因如野生型P53、RB、VHL、人类染色体10q等。P53能抑制VEGFA的表达并支持TSP1的分泌，而TSP1能抑制内皮细胞的黏附、运动和蛋白水解作用;②可溶性介质如IFNα、TSP1、IL8、HP等，其中IFNα能抑制bFGFmRNA的表达;③蛋白质片段如AS、ES等。

　　2.2.1 血管生长抑制素(Angiostatin，AS)和内皮生长抑制素(Endostatin，ES) AS和ES是两种对肿瘤生长有特异抑制作用的新发现的抗血管生成因子，它们能完全抑制巨大肿瘤的生长并诱导其进入休眠状态，是迄今为止发现的疗效最好的血管生成抑制剂。1992年Folkman提出其抗肿瘤机制：①阻止血管生成因子从肿瘤或其他细胞释放。②中和已释放的血管生成因子;③阻止血管内皮细胞对血管生成因子刺激的反应。肿瘤组织中，肿瘤细胞不断产生生长因子保证更多自身血管增生，同时内皮细胞产生更多的生长因子刺激肿瘤细胞生长，一旦封闭生长因子的作用便会导致肿瘤细胞凋亡。有研究发现AS可与只存在于内皮细胞表面的特异黏附受体如整合蛋白αγβ3相互作用，从而阻断了其介导的VEGF、TGFα等的促内皮细胞增生和血管生成作用的共同通道。AS是纤溶酶原内的一个分子量为38 kD的片段，它阻断分裂血浆酶原的催化酶，以致防止血管生成所需的基质再塑造，还可选择性防止内皮细胞对血管生成刺激的应答而致微转移灶休眠〔20〕。ES是Ⅹ、Ⅷ型胶原的C末端片段,其作用亦是阻断胶原酶、妨碍基质再塑化、抑制内皮细胞增殖;重组内皮稳定因子可增加肿瘤的细胞凋亡率7倍之多。Hohenester〔21〕等则发现它与肝素具有高度亲和力。因此ES抑制血管生成的作用机制可能是通过它与肝素的磷酸盐蛋白多糖结合而实现的。

　　2.2.2 血小板反应蛋白 是一种强力的血管生成抑制剂，由内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等所分泌，它可调控内皮细胞黏附动力和蛋白溶解活性。野生型P53就是上调血小板反应蛋白而抑制血管生成的，P53突变后其作用即消失。有资料显示，血小板反应蛋白1下调VEGF表达。

　　2.2.3 凝血栓素(TSP1) 是一种分泌性糖蛋白，调控内皮细胞的黏附、移行和生长，在肿瘤细胞表达水平低。TSP1受成纤维细胞野生型P53肿瘤抑制蛋白调控，也受哺乳动物上皮细胞P53调控;转化中失去了P53，则该抑制剂水平急剧下降。实验表明：①内源性新生血管抑制剂对诱导剂进行反向调控;②新生血管抑制剂受肿瘤抑制基因控制。

　　2.2.4 其他 一些抗血管生成制剂仅影响调节肿瘤血管生成的微环境。其作用不但是间接的，而且效果变异很大，如AGM1470能降低内皮细胞增殖、IFNα干扰内皮细胞迁移、IL12抑制血管生成是通过IFN的作用、苏拉明抑制与bFGF受体的结合、三苯氧胺抑制VEGF介导的内皮细胞增殖和迁移等。

　　3 抗血管生成治疗在肿瘤治疗中的应用及其优越性

　　3.1 抗血管生成疗法的应用 抗血管生成疗法的最终目的是维持肿瘤处于相当小的细胞簇，使转移潜能低下，易受细胞免疫的攻击和易被化疗及放疗破坏。肿瘤休眠疗法的理论根据即与血管生成密切相关。血管生成抑制因子控制转移灶的生长是通过增加肿瘤细胞凋亡而实现的。目前抗血管生成方法主要有两种情况：直接制剂和间接制剂。AS、ES是迄今为止发现的唯一直接抗血管生成制剂，分别为纤溶蛋白溶酶原和胶原蛋白酶解片段。两者特异地作用于内皮细胞增殖，抑制其分裂，是一种理想的休眠疗法。目前在美国已获准进行临床实验。TNP470是目前抑制新生血管效果最为肯定的人工半合成药物，副作用小，已用于Ⅰ、Ⅱ期临床试验〔22〕。随着对血管生成发生机制研究的不断深入，通过导入相关基因促进或抑制血管生成来治疗包括肿瘤在内的一些疾病显示出良好的应用前景。反义VEGF基因转染人黑素瘤细胞SKMEL2，移植大鼠脑内发现比转染VEGF基因细胞株血管明显减少，生长慢，坏死多〔23〕，动物实验证明导入MMR的抑制剂TIMP2基因可显著抑制肿瘤血管生成〔24〕。将血管稳定因子(angiostatin)CDNA转染鼠纤维肉瘤细胞，可以明显抑制肿瘤的增殖和转移，并可使转移瘤进入休眠状态。

　　血管内皮生长因子(VEGF)的过表达与结直肠癌的侵袭力,血管密度转移和复发预后密切相关。VEGF的过表达在乳腺癌和其他肿瘤中预后较差。阿瓦斯丁(Avastin, Bevacizumab)为新型的抗血管内皮生长因子的人源化单克隆抗体，主要通过中和血管内皮生长因子，阻断它和内皮细胞上的受体结合。无论是单独或与其他化疗药物结合Avastin可减少肿瘤血管生成,使肿瘤组织无法获得所需的血液、氧和其他养分而最终“饿死”，以达到抗癌功效。阿瓦斯丁是第一个被美国FDA批准通过抑制血管生成发挥抗癌作用的新药。目前正在进行非小细胞肺癌(NSCLC)，乳腺癌，结直肠癌和头颈部肿瘤以及黑色素瘤和骨髓瘤的III期临床实验和其他实体肿瘤的Ⅱ期临床实验研究〔25〕。

　　3.2 优越性 抗血管生成疗法因其具有独特的优越性而越来越受到人们的注意。特点如下：

　　3.2.1 良好疗效 抗肿瘤治疗常由于肿瘤细胞发生遗传突变而产生耐药性。血管内皮细胞遗传性相对稳定，故避免了化疗易产生的耐药性，AS、ES的全身应用可使肿瘤限制在没有血供情况下的生存体积，使得肿瘤细胞迅速凋亡、残余肿瘤细胞进入休眠状态。

　　3.2.2 对化疗、放疗的增强作用 由于肿瘤生长伴随着间质压力增高，导致肿瘤血供的受压和中心区域的坏死，抗血管疗法通过降低间质压力而增加了化疗药物进入肿瘤，且其抑制肿瘤细胞的作用使肿瘤维持休眠状态,对放疗更敏感。

　　3.2.3 无明显副作用 因其直接作用于血管内皮细胞，针对性强，避免了其他抑制剂非特异性地对细胞分裂的干扰，无一般化疗药的胃肠道反应、骨髓抑制及其他内脏损害。动物试验未发现其对生理血管生长如伤口愈合有明显抑制作用。其用药安全剂量大甚至可达200 mg/kg。

　　4 结 语

　　实体肿瘤生长必须依赖持续和广泛的血管生成。肿瘤血管生成受血管生成促进因子和血管生成抑制因子的共同调控，以血管为靶向的抗肿瘤治疗正日益受到人们的广泛重视，针对血管形成调节因子的基因疗法已在进行探索。基因治疗具有明显的优越性，如通过基因转移技术可使肿瘤组织 局部在相当长的时间内稳定表达血管生成抑制因子，而不需经常注射外源性药物以维持有效浓度;另外，直接以肿瘤组织内皮细胞为靶细胞的抗血管形成基因治疗可以避免长期使用肿瘤血管生成抑制因子可能诱导肿瘤出现的"耐药现象";且基因治疗的靶向性更为明显，因而对正常组织血管形成的影响较小。抗肿瘤血管生成基因治疗丰富了肿瘤综合治疗的内容。

　　肿瘤血管研究这一新领域，仍有许多问题有待解决。血管形成因子诊断肿瘤的特异性、灵敏性需进一步提高，需继续寻找高效低毒的血管形成抑制因子，需进一步深入研究血管形成抑制因子合并化疗、放疗的理论基础和具体方法。虽然抗新生血管疗法单用时，不能根治实体瘤，须与传统治疗手段相结合，才能根治肿瘤。但可以肯定随着肿瘤血管基础研究和应用研究的逐步深入，以肿瘤间质为靶点的抗新生血管疗法在临床上必将有着广阔的应用前景。

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