姜黄素衍生物FM0807体内外抗肿瘤作用研究

　　作者：叶丽香， 张志强， 刘洋， 李鹏， 许建华 作者单位：福建医科大学, 福州 350004 药学院;新药研究所;药物化学系;天然药物化学系

　　【摘要】 　　目的 研究姜黄素衍生物FM0807的体内外抗肿瘤作用。 方法 应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测FM0807对多种肿瘤细胞生长的抑制作用;建立H22小鼠移植肿瘤模型进行体内实验，观察尾静脉、腹腔及口服给予FM0807后体内抗肿瘤活性。 结果 体外抗肿瘤研究表明，FM0807对K562，HL260，MGC803，HepG2，Sw480等多种人肿瘤细胞均有生长抑制作用，IC50分别为5.21，6.25，7.37，24.72，9.72 μg/mL;体内抗肿瘤研究表明，尾静脉、腹腔及口服给予FM0807后对小鼠H22肿瘤生长均有明显抑制作用，抑制率分别达到69.0%，66.3%，52.5%。 结论 FM0807体内外均有较强抗肿瘤作用。

　　【关键词】 姜黄素， 抗肿瘤药， 肿瘤移植，疾病模型，动物

　　Antitumor Effect of Curcumin Derivative FM0807 in vitro and in vivo

　　YE Lixiang, ZHANG Zhiqiang, LIU Yang, LI Peng, XU Jianhua

　　Department of Pharmacology, School of Pharmacy, Fujian Medical University, Fuzhou 350004,China;New Drug Research Insititute of Fujian Medical University, Fuzhou 350004,China;Department of Medical Chemistry,School of Pharmacy, Fujian Medical University, Fuzhou 350004,China;Department of Pharmacology, School of Pharmacy, Fujian Medical University, Fuzhou 350004,China;

　　ABSTRACT: Objective To evaluate the antitumor effect of FM0807 in vitro and in vivo. Methods The MTT assay was used to examine the growth arrest of a variety of tumor cells by FM0807. The H22 mouse tumor xenograft models were established and antitumor effect of FM0807 given by tail vein injection, intraperitoneal injection and oral administration respectively was measured. Results FM0807 remarkably inhibited the proliferation of many kinds of tumor cells. The IC50 values to K562 , HL60，MGC803, HepG2 and SW480 were 5.21, 6.25, 7.37, 24.72 and 9.72 μg/mL respectively. FM0807 showed significant inhibitory effect on H22, the inhibitory rates of FM0807 given by tail vein injection, intraperitoneal injection and oral administration were 69.0%, 66.3%, 52.5%, respectively. Conclusion FM0807 was able to inhibit potently the growth of the tumor cells in vitro and in vivo.

　　KEY WORDS: CURCUMIN; antineoplastic agents; neoplasm transplantation; disease models, animal

　　姜黄素(Curcumin,Cur)是姜科植物姜黄(Curcuma Longa L.)的有效成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、提高免疫力、抗胆结石等广泛的药理作用[l]。近年来，Cur在肿瘤预防和治疗方面的作用越来越引起重视[23]。但Cur水溶性差，水溶液易水解，首过消除现象明显，生物利用度低，成为限制其临床应用的主要因素和产业化的瓶颈，因此对Cur结构改造一直是该领域的研究热点[46]。本课题组设计合成的Cur衍生物FM0807，保留Cur分子中共轭β二酮链等活性必需基团，改进了Cur水溶性差、首过消除现象明显、生物利用度低等缺点，对其进行体内外抗肿瘤研究，报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 药品与试剂

　　Cur(上海试剂三厂)，纯度99%;Cur衍生物FM0807由本实验室合成并提纯，经HPLC及薄层层析分析鉴定，纯度>95%;四甲基偶氮唑盐(MTT，Amreco0793);二甲基亚砜(国药集团化学试剂有限公司，T20081103);RPMI 1640培养基、DMEM培养基及新生牛血清(美国Gibco公司);环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号09021221);泊洛沙姆(沈阳药科大学，批号20041026)。

　　1.1.2 主要仪器

　　体积分数为0.05的CO2及饱和湿度孵育箱(美国Thermo Forma公司);倒置显微镜(日本Olympus公司)，Microplate Reader 450 酶标仪(美国BioRad公司)。

　　1.1.3 细胞株

　　人慢性粒细胞白血病细胞株K562、人早幼粒白血病细胞株HL60、人胃癌细胞株MGC803、人肝癌细胞株HepG2、人结肠癌细胞株SW480等细胞均来源于中科院上海细胞库。

　　1.1.4 动物及瘤株

　　雄性昆明种小鼠[福建医科大学实验动物中心，合格证号：SCX(闽) 20042002]，体质量(20±2)g，共170只;小鼠肝癌H22瘤株(扬州大学比较医学中心)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养

　　K562、HL60、HepG2、MGC803细胞培养于含10%小牛血清、青霉素100 IU/mL和链霉素100 μg/mL的RPMI 1640培养液中，SW480细胞培养于含10%小牛血清、青霉素100 IU/mL和链霉素100 μg/mL的DMEM培养液中。置37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度孵育箱中培养，取对数生长期细胞用于增殖相关实验。

　　1.2.2 MTT法检测细胞增殖

　　取对数生长期的肿瘤细胞，按一定的密度接种于96孔培养板中(贴壁细胞贴壁后)，每孔200 μL。实验组加入不同浓度的FM0807或Cur，对照组加入等体积(含0.5% DMSO)RPMI 1640溶液，每个浓度设3个复孔。37 ℃培养48 h后，每孔加入MTT 20 μL(5 mg/mL PBS配制)，继续培养4 h。离心，弃上清液，每孔加入DMSO 150 μL，微量振荡仪振荡10 min，立即用酶标仪在570 nm波长处测吸光度值。从曲线的线性部分，根据下列公式计算抑制率并计算IC50：

　　抑制率=1-(实验组OD值/对照组OD值)×100%

　　以同一药物的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图，得到剂量反应曲线。从曲线的线性部分，根据线性回归方程求出该药物的半数抑制浓度IC50，即细胞存活率减少50%时的药物浓度。试验重复3次。

　　1.2.3 H22腹水瘤接种传代

　　取肿瘤生长旺盛的小鼠，无菌操作抽取腹水，称体积后按1∶5比例加入无菌生理盐水，取0.2 mL接种于小鼠腹腔内[7]。

　　1.2.4 FM0807体内抗肿瘤作用

　　参照文献[8]，建立H22小鼠肿瘤移植模型(每只接种细胞2×106)。接种肿瘤后按体质量随机分组，设阴性对照组、阳性对照组及FM0807组，每组10只。阳性对照组给予环磷酰胺(30 mg·kg-1·d-1，每3天1次)，阴性对照组给予等量溶剂，FM0807组按给予剂量分为高、中、低剂量组(用泊洛沙姆制备成固体分散体待用)。尾静脉给药，每天1次，连续9 d;腹腔注射给药，每天2次，连续7 d;口服给药，每天2次，连续9 d，停药24 h后脱颈处死，剥瘤称质量并计算抑瘤率：

　　抑瘤率(%)=(1-T/C)×100%

　　T/C：治疗组平均瘤质量/对照组平均瘤质量，实验重复2次。

　　1.3 统计学处理

　　实验结果以x±s表示，用SPSS 13.0统计软件处理，采用t检验和ANOVA法进行显著性检验，P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 对肿瘤细胞的生长抑制作用

　　FM0807对K562，HL60，MGC803，HepG2，Sw480等人肿瘤细胞有一定的生长抑制作用，不同浓度的FM0807作用于肿瘤细胞48 h以后，随着FM0807剂量增加，细胞存活率显著下降，对肿瘤细胞生长抑制率显著上升。对各种肿瘤细胞的半数细胞抑制浓度IC50分别为5.21，6.25，7.37，24.72，9.72 μg/mL。而Cur对上述瘤株的IC50分别为4.50，3.41，4.40，3.78，6.45 μg/mL，可见FM0807的体外抗肿瘤作用均比Cur弱。

　　2.2 体内抗肿瘤作用

　　FM0807在体外对人肝癌细胞HepG2抑制作用较弱，但通过体内代谢出Cur后，对小鼠移植性肝癌肿瘤H22有明显的抑制作用，差别具有统计学意义。FM0807实验组小鼠未出现体质量明显下降、松毛、腹泻等中毒症状，FM0807实验组与对照组比较体质量下降的差别无统计学意义(P>0.05)。表1 FM0807尾静脉给药、腹腔给药、口服给药对小鼠H22 的抑制作用，Tab 1 Inhibition of mice implanted tumor H22 of FM0807 with tail vein administration, intraperitoneal and oral administration。

　　3 讨论

　　姜科姜黄属植物姜黄是一种常用中药，味辛、苦，性温，无毒。Cur是从姜黄中提取的酚性色素，已广泛用作食品添加剂和染料，毒性很低，小鼠的LD50>2 g/kg。自1990年代中期以来，Cur抑制癌细胞增殖，诱导癌细胞凋亡等直接抗癌活性日益受到重视。为提高Cur的抗肿瘤活性，笔者合成了Cur的衍生物FM0807，并对其体内外抗肿瘤活性做了初步评价。细胞增殖抑制实验表明，FM0807的半数细胞抑制浓度IC50均高于Cur的半数细胞抑制浓度IC50，表明 FM0807的体外抗肿瘤活性低于其母核Cur。但FM0807对K562、HL60、SW480等肿瘤细胞仍有明显的抑制作用，平均IC50均小于10 μg/mL，细胞增殖抑制率随FM0807浓度增大而提高，呈剂量依赖关系。其中对人慢性粒细胞白血病细胞株K562最敏感，对肝癌细胞株HepG2不敏感。体内实验结果表明，FM0807对小鼠移植性肝癌H22实体瘤有一定的抑制作用，由于该衍生物为前药，需要在体内代谢出Cur，才对肝癌细胞有明显的抑制作用。静脉、腹腔给药的抑制作用明显优于口服给药。FM0807尾静脉给药200 mg·kg-1·d-1以及FM0807口服给药400 mg·kg-1·d-1量效关系不明显，可能与高剂量FM0807的抗肿瘤作用已经达到最大效应有关。A: K562; B: HL60; C: MGC803; D: HepG2; E: SW480.

　　【参考文献】

　　[1] 吴丽贤,许建华,吴国土,等. 姜黄素对K562细胞增殖的影响及其与P210 bcr/abl激活的Ras信号的关系[J]. 中国药理学通报, 2003, 19(1):3337.

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　　[3] Rao C V,Rivenson A,Simi B,et al. Chemoprevention of colon carcinogenesis by dietary curcumin, a naturally occurring plant phenolic compound[J]. Cancer Res, 1995,55:259266.

　　[4] Dhillon N,Aggarwal B B,Newman R A,et al. Phase II Trial of curcumin in patients with advanced pancreatic cancer[J]. Cancer Therapy: Clin, 2008,14(14): 44914499.

　　[5] 张磊,李杰, 陈国良. 姜黄素衍生物生物活性的研究进展[J]. 沈阳药科大学学报, 2008,25(4):331336.

　　[6] 李娜,吴丽贤,温彩霞,等. 姜黄素衍生物FM04抑制K562细胞增殖及其对P210bcr/abl信号通路的影响[J]. 福建医科大学学报, 2008,42(3):203207.

　　[7] 吴国土,林建忠,王瑞幸,等. 桂苓散的抗癌作用[J]. 福建医科大学学报, 2003,37(1):8991.

　　[8] 徐叔云,卞如濂,陈 修. 药理实验方法学[M].3版,北京:人民卫生出版社, 1994:14461449.