P选择素在结直肠癌的表达及临床意义

　　作者：晋雯 ，林志武 ，高美钦 ，杨代兴 作者单位：福建医科大学病理学系，福州 350004

　　【摘要】 目的 探讨P选择素在结直肠癌细胞的表达情况与临床病理关系及预后的意义。 方法 应用链酶素-生物素(SP)免疫组织化学法，对62例结直肠癌及5例正常肠黏膜进行P选择素的检测。 结果 P选择素在正常组织中未见表达，在结直肠癌组织中阳性表达率为67.74%，其阳性表达与患者的性别、肿瘤的组织分型、分化程度均无关，与癌性血栓形成及Dukes分期有关(P<0.05)。P选择素阳性者5年生存率及平均生存期[52.38%，(33.33±18.52)月]均低于P选择素阴性者[80.00%，(50.83±15.23)月，P<0.05]。 结论 P选择素在结直肠癌中的高表达与肿瘤的转移潜能有关，对判断结直肠癌的预后有参考价值。

　　【关键词】 结直肠肿瘤，P选择素，肿瘤转移，预后

　　选择素是新近发现的细胞黏附分子中一个家族，通过启动肿瘤细胞黏附的始动机制，介导肿瘤细胞与内皮细胞的黏附。其中P选择素存在于血小板与内皮细胞内，能介导内皮细胞和血小板与肿瘤细胞之间相互作用，可能与肿瘤的转移有关 [1-2] 。笔者用免疫组织化学方法研究P选择素在癌组织中的表达，探讨P选择素在结直肠癌转移中的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 1995-1998年福建省立医院资料完整的结直肠癌患者的存档标本62例。一般情况:男性30例，女性32例，年龄(57.26±1.48)岁(78～27岁)。选取5例正常肠黏膜为对照组。所有材料按照全国结肠癌协作组制定的标准 [3] ，由两名病理医生复查确定。

　　1.2 主要试剂 羊抗人单克隆抗体P选择素、SP试剂盒(北京中山生物工程公司)。

　　1.3 方法 蜡块重新制成5μm厚切片，SP法检测P选择素，阳性对照选自已知的阳性片，阴性对照由PBS代替一抗。具体操作步骤如下:(1)切片烤箱烘烤60℃10min，常规二甲苯脱蜡至水化，蒸馏水洗5min;(2)0.1mol/L枸橼酸修复液400mL(pH6.0)隔水蒸馏于高压锅内，待水沸腾，将切片放入修复液内，加盖、加热，喷汽计时3min，保留5min，自来水冲洗至37℃;(3)蒸馏水洗5min×2;(4)滴加A液，室温放置10min;(5)蒸馏水洗5min×2，PBS洗5min×1;(6)滴加B液，放置37℃水浴槽15min;(7)滴加一抗(1∶50)，放置37℃水浴槽1h;(8)PBS洗5min×3;(9)滴加二抗放置37℃水浴槽10min;(10)PBS洗5min×3;(11)滴加D液，放置37℃水浴槽10min;(12)PBS洗5min×3;(13)DAB显色4～8min。

　　1.4 结果判断 以血管内皮细胞细胞膜出现棕黄色为阳性，高倍镜下选择10个视野计数，血管≥5条为阳性，其中5～9条为“+”，10～19条为“”，≥20条为“”。

　　1.5 统计学处理 采用SPSS10.0统计软件包进行t检验。

　　2 结果

　　P选择素在正常肠黏膜中均未见有阳性表达。62例结直肠癌组织中阳性表达为42例，表达率67.74%。阳性表达主要位于中等大小的动静脉的内皮细胞的细胞膜上，毛细血管几乎未见表达。部分肿瘤细胞的细胞膜上有轻度的阳性反应(图1)。P选择素阳性表达12例“+”，8例“”，22例“”。P选择素表达与患者性别、年龄、组织学分型及分化程度无关，但与血栓形成、Dukels分期有关。

　　组内阳性率比较，*:P<0.05. 62例结直肠癌患者均随访5年以上，其中P选择素阴性者20例，死亡4例，5年生存率80%，平均生存期(50.83±15.23)月;阳性表达者42例，死亡20例，5年生存率52.38%，平均生存期(33.33±18.52)月，两者差异有显著性(P<0.05)。

　　3 讨论

　　肿瘤转移是恶性肿瘤致死和临床治疗远期疗效差的主要因素，肿瘤转移是一个复杂的多分子参与的多环节过程，主要包括下列过程:癌细胞在原发瘤上的分离、脉管内异质或同质瘤栓形成、在靶器官大量增殖形成转移灶。其中与血管或淋巴管的黏附是肿瘤转移过程中的一个关键环节。在这一过程中，肿瘤细胞移动速度减缓，从轴流进入边流，进而在内皮细胞表面滚动，以利于其黏附与渗出，整个过程类似于白细胞在炎症局部的聚集与滚动。该过程有可能部分是由选择素蛋白所介导的，包括P选择素 [1-2] 。P选择素是一类涉及白细胞与内皮细胞的黏附分子，为高度糖基化的单链跨膜糖蛋白，结构特点是其细胞外区域的氨基末端有凝集素样区，约含120个氨基酸残基，接着为表皮生长因子样区，约含40个氨基酸残基，最后与跨膜区相接的是一系列重复的蛋白区 [4] 。P选择素主要集中在小静脉、微静脉内皮细胞和血小板α颗粒内，经凝血酶、组胺或白三烯C 4 等刺激后，P选择素可被动员与质膜融合而在细胞表面表达，使内皮细胞、血小板与中性粒细胞、单核细胞间产生黏附，参与炎症和血栓形成 [5-6] ，是启动炎症反应并维持炎症状态的重要成分 [7] 。近年来研究发现，P选择素不仅在炎症过程中发挥重要作用，而且在肿瘤的转移过程中也存在类似的作用 [8-10] 。

　　本研究结果显示，P选择素在癌组织中阳性率为67.74%，在癌巢周围的血管及有癌性血栓形成的血管的内皮细胞多呈阳性表达，而在正常组织不表达，与既往的研究结果基本一致 [4，11] 。P选择素阳性表达与患者的性别、肿瘤的分型、分化程度均无关，而与癌性血栓形成及Dukes分期有关(P<0.05)，提示P选择素与肿瘤转移有关。随访结果表明，P选择素与患者的预后有关，可做为预测结直肠癌转移与预后的指标。

　　研究表明，许多上皮型肿瘤能分泌肿瘤黏蛋白及sLex抗原，而后者正是P选择素的配体。肿瘤细胞一方面分泌多种细胞因子和血管通透因子，促使内皮细胞释放和表达P选择素，另一方面通过自身sLex表达上调增强与P选择素阳性内皮细胞的配 接。有文献报道，P选择素参与肿瘤血行转移的分子学基础在于其与sLex抗原的碳水化合物结构结合后，可调节肿瘤细胞在血管内皮细胞上的滚动 [12] 。Kim等认为，P选择素在发生黏蛋白性肿瘤转移过程中的作用机制与肿瘤细胞-血小板-白细胞三聚体及其与远处脏器内皮细胞的相互作用有关 [13] 。笔者发现，有癌性血栓形成的血管内皮细胞P选择素多呈阳性表达。可以推测肿瘤细胞一方面诱导血管内皮细胞表达P选择素，使自身易于进出血管，另一方面肿瘤细胞又可诱导血小板表达P选择素，再与血小板黏附，形成瘤栓以促进转移。Hakomori等发现肿瘤细胞可刺激血小板表达P选择素，但并不与之结合 [14] 。Stone则得出相反结果，两种小细胞肺癌和两种神经肉瘤的细胞可与血小板结合，而另外一种肺癌细胞与6种其他来源的肿瘤细胞则不与血小板结合 [15] 。而Kim用敲除掉P选择素的小鼠所做的实验表明，移植于皮下的肿瘤生长速度减缓，静脉注射的肿瘤发生肺转移的机率也大大降低 [13] 。官成浓等提到高水平的P选择素又可抑制中性粒细胞及单核细胞的黏附与呼吸爆发，从而使肿瘤细胞逃避吞噬细胞的杀伤，易发生转移 [16] 。笔者的研究显示，在P选择素阳性表达组中，多数病例为强阳性表达，也观察到P选择素强阳性表达的标本中常可见中性粒细胞浸润，这种情况有可能是肿瘤形成后刺激炎症的产生或肠癌并发肠炎，而炎症的产生进一步激活血管内皮细胞，继而呈现P选择素的高表达。这种阳性表达程度上的差异是否如官成浓认为的更有利于肿瘤的转移?由于本次研究的标本量不足以进一步分组研究，有待今后研究证实。

　　在本实验中，P选择素不仅在血管的内皮细胞上有阳性表达，在部分肿瘤细胞的细胞膜上亦可见阳性表达，提示P选择素可能在癌细胞与血管内皮细胞间存在双重作用，即肿瘤细胞一方面诱导血管内皮细胞表达P选择素，使肿瘤细胞通过sLex-sel P配体结合的形式，促进肿瘤细胞与血管的粘连;另一方面可能通过某些未知的机制促使肿瘤细胞表达P选择素，如果在血管壁上找到能与其相结合的蛋白，那么P选择素阳性表达的肿瘤细胞显然有利于浸润和转移。本文显示，P选择素与结直肠癌的转移与预后密切相关，显示癌细胞在表达P选择素的内皮细胞部位有更高的浸润、侵袭和形成新的肿瘤转移灶的可能性，然而它们之间的作用机制相当复杂，有待进一步探讨。

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