EGCG对鼻咽癌细胞株裸鼠移植瘤的放疗增敏作用以及对Survivin表达的影响

　　作者：雷迅，刘强和，孔中雨，向秋，耿宛平，黄辉，董译元，刘芳贤 作者单位：1. 桂林医学院附属医院耳鼻咽喉- 头颈外科， 2. 桂林医学院科学实验中心，3. 桂林医学院附属医院肿瘤放疗科, 广西 桂林

　　【摘要】 目的 研究凋亡抑制基因Survivin的表达与EGCG对鼻咽癌CNE2裸鼠移植瘤放疗增敏作用的关系。方法 将低分化鼻咽癌细胞CNE2接种于4～6周龄的雌性裸鼠皮下，待移植瘤生长至4～6mm时，随机分为4组，分别采用NS、EGCG[50mg/(kg·w)]、放疗(15Gy)、EGCG给药24h后再行放疗等方法分别处理各组裸鼠，处理前后分别测量裸鼠移植瘤的短径、体积。21d后处死裸鼠，取出肿瘤并称重，将肿瘤组织分成两份，分别用来进行病理切片TUNEL染色以及RTPCR检测Survivin mRNR的表达。结果 EGCG+放疗对裸鼠移植瘤的生长抑制最为明显，肿瘤生长抑制率为89.3%，消退率为40.0%。与对照组EGCG组、放疗组相比，EGCG+放疗组的凋亡指数均明显增加(P<0.05)，同时，伴有Survivin mRNR的表达显著下降(P<0.05)。结论 EGCG对鼻咽癌裸鼠移植瘤可能具有放疗增敏作用，这种作用可能与凋亡抑制基因Survivin的表达下调有关。

　　【关键词】 鼻咽肿瘤; 肿瘤移植; EGCG; 放射疗法; Survivin;

　　effect of EGCG in xenotransplanted nasopharyngeal carcinoma

　　LEIXun1, LIU Qianghe1, KONG Zhongyu1, XIANG Qiu2, GENG WANping1,

　　HUANG Hui3, DONG Yiyuan, LIU Fangxian1

　　(1. Department of Otorhinolaryngology & Head and Neck Surgery, Affiliated Hospital of Guilin Medical College;

　　2. Scientific Research & Experiment Center, Guilin Medical College;

　　3. Department of Radioncology, Affiliated Hospital of Guilin Medical College, Guilin 541001, Guangxi, China )

　　To investigate the relationship between expression of Survivin and radiosensitization effects of EGCG in the in vivo growth of nasopharyngeal carcinoma. Methods The nasopharyngeal carcinoma undifferentiated cell line (CNE2) was subcutaneously inoculated into 20 nude mice (46weeks, female), and the volume and the shorter diameter of tumors were determined. When the shorter diameter of tumors reached 46?mm, NS, EGCG(50?mg/kg·w), radiotherapy(15?Gy), and EGCG(50?mg/kg·w) followed by radiotherapy(15?Gy) 24 hours later, were administered to the animals. The volume and the shorter diameter of tumors were checked. The excised tumor masses on the 21st day after administration were frozen and processed for reverse transcriptionpolymerase chain reaction(RTPCR) to investigate expression of Survivin mRNR. At the same time, one part of each tumor mass was processed for immunohistochemical TUNEL staining to get the apoptosis index(AI). Results EGCG in combination with radiotherapy showed a significant inhibitory effect on both tumor growth and expression of Survivin mRNA(P<0.05). The apoptosis index increased after EGCG treatment in combination with radiotherapy(P<0.05). Conclusion EGCG is a good choice for the treatment of nasopharyngeal carcinoma and has radiosensitization on nasopharyngeal carcinoma. Survivin is a molecular agent taking part in the course of apoptosis induced by EGCG in combination with radiotherapy. 山东大学耳鼻喉眼学报23卷1期

　　雷迅，等.EGCG对鼻咽癌细胞株裸鼠移植瘤的放疗增敏作用以及对Survivin表达的影响 大量研究证实，EGCG既可诱导鼻咽癌细胞凋亡，又能抑制鼻咽癌细胞增殖[12];但是，这些结论均源于体外实验，缺乏体内实验研究，此外，EGCG是否存在放疗增敏作用?如果有的话，其放疗增敏机制如何?为此，以下实验将建立鼻咽癌低分化细胞株(CNE2)裸鼠移植瘤进行EGCG联合放射治疗的体内实验。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要药物和试剂 EGCG(Sigma);RPMI1640培养基(GIBCOBRL);DMSO(Sigma);细胞凋亡检测试剂盒(武汉博士德生物有限公司);图像分析系统(北航GM2000);Survivin、以及内对照βactin PCR引物设计: Survivin(338bp): Forward Primer:5′GGACCACCGCATCTCTACAT3′,Reverse Primer:5′GCACTTTCTTCGCAGTTTCC3′;βactin(500bp):Forward Primer: 5′TCAGAAGGACTCCTATGTGG3′;Reverse Primer: 5′TCTCTTTGATGTCACGCACG3′。

　　1.2 细胞系和培养条件 人鼻咽癌低分化细胞株CNE2 (中南大学肿瘤研究所) RPMI1640培养基中，37?℃、5%CO2开放式培养。

　　1.3 鼻咽癌细胞株裸鼠移植瘤模型的建立、分组处理、以及标本预处理 将处于指数生长期的CNE2细胞用无血清RPMI1640培养液稀释细胞浓度为5×106/mL备用;裸鼠20只(18～20?g/只)，在严格无菌条件下将细胞悬液注于裸鼠前腋皮下，每只0.2?mL(1×106)。5～7?d后，待肿瘤长至4～6?mm时，将裸鼠随即分组并编号：对照组、EGCG组、放疗组、EGCG+放疗组，每组各5只。

　　处理方法：对照组，每只注射生理盐水0.3?mL/次;EGCG组，每只裸鼠按EGCG 50?mg/(kg·w)，EGCG药剂浓度10?mg/mL, 注射生理盐水稀释，腹腔给药，每次0.3?mL;放疗组，直线加速器照射，每次每只肿瘤局部给予5?Gy X射线照射，3?d后再次照射，5?Gy/只，共15?Gy/只;EGCG+放疗组，每只裸鼠按EGCG 50?mg/kg注射24?h后给予放疗组相同剂量照射(5?Gy/只)，共3次。

　　疗效观察：从治疗开始起为第1天，给药及放疗期间每隔2d测量移植瘤体积，3周后断颈处死动物，称量体重，用游标卡尺测量移植瘤体积，解剖出裸鼠移植瘤，电子天平称重。

　　肿瘤生长的测定：按照肿瘤体积公式(V)=(a×b2)/2 (a为肿块长径，b为肿块短径);肿瘤生长抑制率=[(1-处理组肿瘤体积/对照组肿瘤体积)×100%];肿瘤消退率=肿瘤消退的例数/该组的总只数×100%。

　　将取出的肿瘤分成2份备用，一份用于常规石蜡切片，TUNEL染色，以其阳性率代表移植瘤的细胞凋亡指数(apoptosis index, AI);另一份保存于-70?℃超低温冰箱中用于抽提RNA，进行RTPCR，用来检测移植瘤组织中Survivin mRNA的表达水平。

　　1.4 石蜡切片的TUNEL染色以及图像分析 按武汉博士德生物有限公司细胞凋亡检测试剂盒操作说明操作。细胞凋亡检测试剂盒内容：标记缓冲液(Labeling Buffer)1?mL;末端脱氧核糖核酸转移酶(TDT，×20)20?μL;地高辛标记的dUTP(DIGdUTP，×20)20?μL;封闭液(blocking Reagent)4?mL;生物素化抗地高辛抗体(×100)20?μL;链酶亲合素-过氧化酶(SABC，×100)20?μL;Proteinase K(×200)50?μL。石蜡切片的TUNEL染色方法：①切片脱蜡、水化;②消除内源性过氧化物酶活性;③Proteinase K 消化;④切片标本加标记液(含TdT及DIGdUTP)标记，阴性对照切片仅加标记缓冲液，37?℃标记2?h;⑤封闭液封闭30?min;⑥生物素化抗地高辛抗体，37?℃反应30?min;⑦加SABC 37?℃反应30?min;⑧3,3，二氨基联苯胺盐酸盐显色，光学显微镜下掌握，且四组切片须同时中止显色;⑨苏木素轻度复染、梯度酒精上行脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。光学显镜下观察，数码拍照。细胞核内有棕黄色或黄色颗粒或斑片者为TUNEL阳性细胞，即凋亡细胞，用北航GM2000图像分析系统对每张免疫组织化学切片在10×40倍下分别随机选5个视野，测定视野内所有TUNEL染色阳性率，输出数据为TUNEL染色阳性率。

　　1.5 RTPCR技术 Trizol试剂盒抽提裸鼠鼻咽癌移植瘤组织RNA，逆转录合成cDNA第1链，PCR反应：各反应体系50?μL,含10×PCR缓冲液，10?mmol/L dNTP，25?mmol/L MgCl2，Taq酶5?U，上下游引物各10?μmol/L。反应条件：94?℃预变性5?min， 94?℃变性40?s，56?℃退火1?min， 72?℃延伸1?min，30循环。72?℃充分延伸5?min。PCR产物琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，BioRadVDS图像系统对电泳带进行光密度值测定，计算Survivin和βactin的比值，以其代表Survivin mRNA相对定量表达水平。

　　1.6 统计学处理 TUNEL染色阳性率、Survivin mRNA相对定量计量资料实验结果均以(±s)表示，差异显著性采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。统计软件采用SPSS 12.0。

　　2 结 果

　　2.1 实验前后的各组裸鼠移植瘤的短径 治疗前各组裸鼠移植瘤的短径之间差异无统计学意义(P>0.05);治疗后对照组与其他各组之间差异均有统计学意义(P<0.05);EGCG组与放疗组、EGCG组与EGCG+放疗组裸鼠组、以及放疗组与EGCG+放疗组裸鼠组之间差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。表1 各组裸鼠移植瘤的短径

　　2.2 实验前后的各组裸鼠移植瘤的体积 治疗前各组裸鼠移植瘤的体积之间差异无统计学意义(P>0.05);治疗后对照组与其他各组之间差异有统计学意义(P<0.05);EGCG组与放疗组、EGCG组与EGCG+放疗组裸鼠组、以及放疗组与EGCG+放疗组裸鼠组之间差异也有统计学意义(P<0.05)。见表2。表2 各组裸鼠移植瘤的体积(V/mm3)

　　2.3 实验前后的各组裸鼠移植瘤的重量 裸鼠移植瘤的重量治疗后对照组为(2.94±0.48)mg,与其他各组之间差异有统计学意义(P<0.05);EGCG组[(1.52±0.32)mg]与放疗组[(0.46±0.15)mg]、EGCG组与EGCG+放疗组[(0.11±0.05)mg]裸鼠组、以及放疗组与EGCG+放疗组裸鼠组之间差异均有统计学意义(P<0.05)。

　　2.4 裸鼠移植瘤肿瘤生长抑制率、消退率 裸鼠移植瘤肿瘤生长抑制率在EGCG组为49.9%，放疗组为67.6%，EGCG+放疗组为89.3%。EGCG组5只裸鼠的移植瘤均未完全消退，消退率为0.0%;放疗组5只裸鼠中有1只的移植瘤完全消退，消退率为20.0%;EGCG+放疗组5只裸鼠中有2只的移植瘤完全消退，消退率为40.0%。

　　A为对照组，B为EGCG组，C为放疗组，D为EGCG+放疗组〖KH*2D] 实验后的各组裸鼠移植瘤的凋亡指数(AI)：即TUNEL染色阳性率。治疗后裸鼠移植瘤的凋亡指数在对照组为(6.68±2.69)%，EGCG组为(13.12±5.57)%，放疗组为(20.06±7.23)%， EGCG+放疗组为(28.70±7.45)%。对照组与其他各组之间差异有统计学意义(P<0.05);EGCG组与放疗组、EGCG组与EGCG+放疗组裸鼠组以及放疗组与EGCG+放疗组裸鼠组之间差异亦均有统计学意义(P<0.05)。

　　2.6 RTPCR检测各组裸鼠移植瘤中Survivin mRNA表达 在所有各组均检测到Survivin基因(300?bp附近)和内参照βactin基因(500bp附近)的表达，见图2。裸鼠移植瘤的Survivin mRNA表达的相对水平，治疗后对照组为0.69±0.05，EGCG组为0.48±0.08，放疗组为0.24±0.14， EGCG+放疗组为0.06±0.07，对照组与其他各组之间差异有统计学意义(P<0.05);EGCG组与放疗组、EGCG组与EGCG+放疗组裸鼠组以及放疗组与EGCG+放疗组裸鼠组之间差异亦有统计学意义(P<0.05)。

　　各组裸鼠移植瘤中Survivin mRNA的表达

　　3 讨 论

　　尽管鼻咽癌对放射治疗敏感，近年来对于鼻咽癌的诊断及治疗技术也在不断发展，患者的治疗效果及生存时间也有了明显的改善，但是，其诊治后5年生存率仍只有50%左右，特别是晚期患者的治疗效果及生存时间更差强人意。因此，寻找更有效的药物与放疗配合使用以提高疗效已是一个非常紧迫的问题。

　　EGCG是绿茶萃提物，富含酚性羟基，还原电位高，抗氧化能力强;它的神奇药理效应之一就是抗癌作用[3]。近年研究证明，EGCG可以抑制肿瘤细胞的生长，并可以诱导多种肿瘤细胞凋亡而发挥其特殊的抗癌作用;其抗癌药效药理表现在[1,4]：影响肿瘤细胞的生长周期;抑制bcl2蛋白表达水平;影响癌基因如cmyc、craf、chras、bcl2等的表达，从而发挥抗癌药效;调节某些致癌物的代谢;影响机体内一些与癌变有关的酶如鸟氨酸脱羧酶、超氧化物歧化酶、谷胱苷肽S转移酶等的活性;诱使癌细胞DNA断裂。但是，这些结论均源于体外实验，缺乏体内实验研究支持，此外，EGCG是否存在放疗增敏作用?如果有的话，其放疗增敏机制如何?

　　本研究结果显示，EGCG、放疗、EGCG联合放疗均能显著抑制鼻咽癌低分化细胞株裸鼠移植瘤的生长(P<0.05)，而EGCG联合放疗比单纯的EGCG治疗或放射治疗对鼻咽癌低分化细胞株裸鼠移植瘤具有更好的生长抑制作用(P<0.05)。实验结束时EGCG联合放疗组的移植瘤生长抑制率达89.3%，而移植瘤消退率达40.0%;实验结束时EGCG联合放疗组的移植瘤平均短径、平均体积、平均重量均低于对照组、EGCG组、以及放疗组(P<0.05)。这些结果均充分证实了EGCG联合放疗对鼻咽癌低分化细胞移植瘤具有明显的增敏效应。同时，研究结果也显示，EGCG联合放疗能显著抑制鼻咽癌低分化细胞株裸鼠移植瘤组织中的Survivin mRNA的表达，而Survivin作为凋亡抑制蛋白家族中的一个成员，是目前为止发现的最强的凋亡抑制因子[56]，表达于人与哺乳动物的胚胎发育组织和人类大多数肿瘤组织中(如部分喉癌、神经母细胞瘤、乳腺癌、胃癌、鼻咽癌等中Survivin呈不一致的阳性表达[79])，而在分化成熟的成人组织中不表达,而且与肿瘤的分化、凋亡指数等多种临床指标、治疗敏感性以及预后均密切相关[1012]。因此，EGCG联合放疗由于能够显著抑制鼻咽癌低分化细胞株裸鼠移植瘤组织中的Survivin mRNA表达，就可以增加移植瘤对放射治疗的敏感性，即更容易诱导移植瘤细胞凋亡，在实验中则表现为EGCG联合放疗组裸鼠移植瘤切片TUNEL染色阳性率更高(P<0.05)。

　　上述研究表明，在对鼻咽癌的治疗中， EGCG对鼻咽癌放疗可能具有增敏作用，因而EGCG有着较大的应用潜力。但是也应注意到，单纯应用EGCG治疗鼻咽癌低分化细胞株裸鼠移植瘤的能力非常有限(肿瘤消退率为0)。此外，EGCG联合放疗抑制鼻咽癌低分化细胞株裸鼠移植瘤组织中的Survivin mRNA表达的具体机制尚待进一步研究阐明。

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