探讨survivin蛋白在宫颈癌组织中化疗前后的表达、细胞凋亡及临床意义

　　作者：张振宇 作者单位：苏州大学附属第四医院，江苏 无锡 214062

　　【摘要】 目的：探讨survivin蛋白在宫颈癌组织中化疗前后的表达、细胞凋亡及临床意义。方法：收集无锡市第四医院2005年1月至2007年3月行动脉灌注化疗(A组)静脉化疗(B组)+手术治疗且临床分期为Ⅰb～Ⅱa期宫颈癌40例患者的完整病历资料。检测治疗前后各组survivin蛋白表达率和表达量。结果：(1)宫颈癌的总有效率A、B两组分别为70.00%和55.00%，A组与B组对宫颈癌的总有效率差异有统计学意义(P<0.05);(2)A、B两组治疗后宫颈癌组织survivin蛋白的阳性表达率及表达量均明显下降，差异有统计学意义(A组P<0.01，B组P<0.05);A组与B组的survivin阳性表达量下降量差异有统计学意义(P<0.05)。(3)治疗后宫颈癌组织细胞凋亡指数(AI)增高，差异有统计学意义(A组P<0.01，B组P<0.05);A组与B组的AI增高值有统计学差异(P<0.05)。结论：A、B两种治疗法均可降低宫颈癌survivin蛋白的表达率和表达量、提高AI，但A组治疗效果明显优于B组。

　　【关键词】 宫颈癌 化疗 survivin蛋白

　　Evaluate the Expression of Survivin In Cervical Cancer Tissue Before and After Chemotherapy,Cell Apoptosis of Cervical Cancer and Clinical Significance

　　ZHANG Zhen-yu,PU Hong,YANG Kai,et al

　　(The First Affiliated Hospital of Suzhou University,Wuxi,Suzhou 214062,China)

　　Abstract:Objective To evaluate the expression of survivin in cervical cancer tissue before and after chemotherapy,cell apoptosis of cervical cancer and clinical significance.Methods 40 patients with stage Ⅰb～Ⅱa cervical cancer were included in this study.One group were carried out arterial interventional chemotherapy and surgeon.The other group were carried out intravenous chemotherapy and surgeon.Expression of surviving protein and apoptosis index in cervical cancer tissue were tested in both groups before and after therapy.Results the effective rate of arterial interventional chemotherapy was 70%,and the rate of intravenous chemotherapy was 55%.The difference between the two groups showed no significant (P<0.05).Expression of surviving protein and apoptosis index were decreased after arterial interventional chemotherapy (P<0.01) and intravenous chemotherapy (P<0.01).Apoptosis index was in both two groups,with significant difference (P<0.01).Pathologic relapse rate was significant different in two groups(P<0.01).Conclusion Chemotherapy was effective to cervical cancer,and the effective rate was different between arterial interventional chemotherapy and intravenous chemotherapy.

　　Key words: Cervical cancer;Hemotherapy;Proteinum of survivin

　　宫颈癌发病率在女性恶性肿瘤中仅次于乳腺癌居第二位，在发展中国家妇女中其发病率居第一位。近年的发病有明显的年轻化趋势;手术和放疗是治疗宫颈癌的主要方法，有较好的治疗效果，但局部晚期宫颈癌,此类肿瘤不易控制,预后差。如何提高局部晚期宫颈癌治疗效果，故探讨survivin蛋白在宫颈癌组织中化疗前后的表达、细胞凋亡及临床意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　选择收集无锡市第四医院2005年1月至2007年3月行动脉灌注化疗(A组)+手术、静脉化疗(B组)+手术治疗且临床分期为Ⅰb～Ⅱa期并经病理证实的60例宫颈癌患者的资料。年龄24岁～62岁，平均40.5岁，中位数为41岁。其中≤40岁8例，A组5例，B组3例。本组病理鳞癌35例，腺癌5例。

　　1.2 综合治疗方法

　　根据临床分期结合患者意愿进行相应的综合治疗，主要有：动脉灌注化疗+手术、静脉化疗+手术。动脉灌注化疗法：常规seldinger’s法，利多卡因局麻下从一侧股动脉穿刺进入，分别进入双侧髂内动脉，动脉造影了解肿瘤供血动脉(靶血管)及肿瘤大小，超选插管进入靶血管后分别通过微泵进行持续30 min的灌注化疗，然后用新鲜明胶海绵栓塞靶血管。动脉灌注化疗的基本方案是DDP 80 mg+E-ADM 60 mg+5-FU 1 g(总量)。术后局部加压包扎，制动24 h，给予静脉水化、利尿以保护肝肾功能，抗生素预防感染。动脉灌注化疗1疗程～2疗程。静脉化疗方案：DDP 30 mg+5-FU 0.75 g，静滴3 d，治疗后10 d～14 d常规妇科检查、CT或MRI或B超、血常规检查，以评价治疗后的临床疗效，确定能否手术。5例动脉灌注化疗后14 d行第二疗程动脉灌注化疗，放化疗组6例放疗后间隔14 d行第二次静脉化疗，临床评估后手术。其余29例均一次治疗后，临床评估后手术。最后一次治疗后10 d～14 d后手术治疗。

　　1.3 临床疗效观察及评定标准

　　根据治疗后妇科检查，结合CT或MRI或B超，参照按WHO的标准评价近期疗效(最后一次治疗后10 d～14 d)：可见的肿瘤病变完全消失即完全缓解(CR)，肿瘤病灶的最大直径及其最大垂直横径的乘积缩小达50%以上即部分缓解(PR)，肿瘤病灶的两径乘积缩小不足50%或增大不超过25%即稳定(SD)，肿瘤病灶的两径乘积增大25%以上或出现新病灶即恶化(PD)。总有效率=CR+PR。

　　1.4 survivin和细胞凋亡的检测方法

　　1.4.1 取样

　　术前活检标本经10%中性甲醛溶液固定后常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片。术后大体标本进行病理学处理，经10%中性甲醛溶液固定后常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片。

　　1.4.2 主要试剂

　　TUNEL试剂盒、survivin兔抗人多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.4.3 免疫组织化学技术S-P法。

　　1.4.4 对照

　　TUNEL法以不加TdT做阴性对照，已知凋亡细胞阳性的标本作为阳性对照;免疫组化EnVision法用PBS代替—抗做阴性对照，以胞质或胞核内出现棕黄色颗粒为阳性标准。

　　1.5 结果判定

　　TUNEL法标记肿瘤细胞，胞核出现棕黄色或黄色为凋亡细胞，凋亡细胞多为散在分布，部分可呈局灶性分布。在400倍显微镜下进行观察计数，每一个标本组织片随机观察5个视野，分别计算每一病例的阳性染色的肿瘤细胞与所测肿瘤细胞的比例，作为凋亡指数(AI)。Survivin的免疫组化结果判断：镜检显示细胞质或细胞核染色为淡黄色至棕黄色为阳性标志。表达结果采用半定量法分析计数。Survivin阳性信号呈棕黄色颗粒，主要位于细胞质。每张切片检测5个高倍视野，根据肿瘤细胞的染色程度及染色细胞百分率进行分析评分，通过400倍高倍镜下观察至少5个视野，取其平均值来确定。因为肿瘤细胞染色不均一，按染色强度主要形式进行评分。不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;着色数≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。两者积分乘积大于1分定义为阳性。阳性信号采用图像分析仪进行定量分析。运用Leica-Q500IW(德国)自动图像分析系统，在×200镜下随机选择5个视野，每个视野系统自动随机测定3个不同的部位，提取阳性细胞，测定光密度值(A)。

　　1.6 统计学处理

　　本文所有数据均采用SPSS11.0统计软件进行统计。细胞凋亡和增殖指数用均数±标准差表示。采用t检验，χ2检验。差异显著性水平为P<0.05。

　　2 结果

　　2.1 宫颈癌治疗前survivin的表达

　　Survivin在宫颈癌中阳性表达率为80%(32/40)，蛋白表达的平均值为1.1654±0.0026。

　　2.2 动脉灌注化疗前后survivin的表达

　　动脉灌注化疗前survivin的阳性表达率为85%(17/20)，蛋白表达量的平均值为1.1656±0.0024。化疗后的阳性表达率为65%(13/20)蛋白表达量的平均值为1.1591±0.0022。治疗后survivin的阳性表达率及蛋白表达量均明显下降，差异具有显著性(P<0.01)。

　　2.3 静脉化疗前后survivin的表达

　　静脉化疗同步放疗前survivin的阳性表率为75%(15/20)，蛋白表达量的平均值为1.1654±0.0012;治疗后的阳性表达率为55%(11/20)，蛋白表达量的平均值为1.1623±0.0021。治疗后survivin的阳性表达率及蛋白表达量均下降，差异有显著性(P<0.05)。

　　2.4 动脉灌注治疗与静脉化疗对survivin的差异性

　　动脉灌注治疗与静脉化疗survivin阳性表达量下降量差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.5 两种综合治疗法对宫颈癌组织survivin和细胞凋亡的关系

　　Survivin蛋白阳性组AI值较survivin阴性组的AI值低，差异具有显著性，survivin的加权计分和AI之间呈明显的负性相关。两种综合治疗法对宫颈癌组织的survivin表达量及细胞凋亡指数的变化差异有统计学意义。动脉灌注化疗(P<0.01)，静脉化疗(P<0.05)(见表1)。表1 两种综合治疗对宫颈癌组织survivin和细胞凋亡指数(AI)的影响(略)

　　3 结论

　　A、B两种治疗法均可降低宫颈癌survivin蛋白的表达率和表达量、提高AI，但A组治疗效果明显优于B组，

　　4 讨论

　　4.1 宫颈癌的治疗现状

　　宫颈癌发病率在女性恶性肿瘤中仅次于乳腺癌居第二位，在发展中国家妇女中其发病率居第一位。近年的发病有明显的年轻化趋势;人乳头瘤病毒(HPV)感染是其主要原因。手术和放疗是治疗宫颈癌的主要方法，早期宫颈癌手术或放疗有较好的治疗效果，手术治疗I期5年生存率达到90%，II期70%以上，放射治疗总的5年生存率50%～70%。FIGO于1985、1988、及1991年分别对130多个单位治疗的96023例各期宫颈癌进行综合分析，总的5年生存率55.0%～53.5%[1]。局部晚期宫颈癌(Locally advanced cervical cancer)是一组具有高危因素的宫颈癌,其广义的范围包括Ⅰb2～Ⅳa期宫颈癌,狭义的范围则是指局部肿瘤直径>4 cm的Ⅱa期以下的早期宫颈癌,此类肿瘤不易控制,手术难度大,容易发生淋巴结转移或远处转移，预后差。5年生存率降至50%～60%，传统的治疗模式包括放疗与根治术没有达到预期的改观。如何提高局部晚期宫颈癌治疗效果，是当前面临的艰巨任务。

　　4.2 新辅助化疗在宫颈癌的治疗

　　一直认为宫颈癌对化疗不敏感，仅将化疗用于晚期与复发患者的姑息治疗。早在1982年FREI提出肿瘤手术前早期辅助化疗的概念，这种辅助化疗的时间不宜太长，一般给1个～3个化疗疗程。新辅助化疗的优点，可避免体内潜伏的继发病灶在原发病灶切除后1 d～7 d内由体内肿瘤总量减少而加速增殖;可避免体内残留的肿瘤在手术后因血凝机制加强及免疫抑制而容易转移;降低癌细胞活力，不易播散;可以切除肿瘤标本了解化疗敏感性;肿瘤缩小有利手术切除;早期化疗可防止远处转移。随着肿瘤化疗的基础与临床研究的迅速发展，化疗药物的不断开发及给药途径和方法的改进，化疗对宫颈癌取得了一定疗效，宫颈癌的化疗越来越受到国内外学者的重视。

　　4.3 宫颈癌与survivin

　　生存素(surviving)是新近发现的一种肿瘤特异性凋亡抑制基因，是凋亡抑制蛋白(inhinbitor of apoptosis protein，IAP)家族新成员，具有抑制细胞凋亡和调节细胞分裂的双功能蛋白，同时参与血管形成的作用。Survivin可抑制多种凋亡刺激因子引起的凋亡，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子[3]。Survivin和其他IAP蛋白的分布和表达模式不同，其他IAP蛋白在生理情况下广泛分布于成人各种组织中，不同之处仅为表达水平的不同;Survivin仅表达于胚胎和胎儿发育过程中，并且随着胚胎组织的发育成熟，Survivin的分布逐步局限，表达水平逐渐降低直至不表达。在正常成人，除了在胎盘、胸腺、增生期和分泌期的子宫内膜中有较弱的表达外，其余正常分化成熟组织均未发现。Survivin在几乎所有的癌组织中均有表达[4]。宫颈癌survivin阳性患者的5年生存率明显低于阴性患者(P=0.02)。宫颈癌的survivin的表达35%～66.7%，与肿瘤不良预后、细胞的分化程度、临床分期、LNM和肿瘤浸润有明显关系[5]。现有研究[4-6]表明肿瘤的发生发展不仅是细胞增殖失控、分化异常的结果，而且与细胞凋亡失衡有关。多种因素综合作用，导致细胞过度增殖和(或)凋亡抑制，进而造成细胞无限生长，从而形成肿瘤。Survivin是新近发现的一种凋亡抑制基因，其独特的结构、特殊的组织分布和作用机制及明显的抗凋亡作用尤为引人注目[4-9]。文献[5-7]报道的宫颈癌的survivin的表达35%～90%，survivin蛋白的表达率和表达量与肿瘤不良预后、临床分期、淋巴结转移和肿瘤周围浸润成正相关。survivin与细胞凋亡指数成负相关[7]。本研究表明survivin在宫颈癌中阳性表达率为80%(32/40)。术前治疗后术后survivin蛋白的表达率和表达量与肿瘤不良预后、临床分期、淋巴结转移和肿瘤周围浸润成正相关。本研究表明survivin蛋白阳性组细胞凋亡指数(AI)较survivin阴性组低，差异具有显著性，survivin的加权计分和细胞凋亡指数(AI)之间呈明显的负性相关。

　　4.4 宫颈癌化疗的目的

　　宫颈癌化疗的目的主要有[2-3,10]：缩小瘤体，利于肿瘤的完整切除及放疗后肿瘤的稳定性;改善宫旁浸润情况，使其分期下降至可以手术的期别，即降分期，为手术治疗创造机会;降低癌细胞的活力，消灭微小转移灶，减少术中播散及术后转移;消除亚临床病灶，减少复发的潜在危险;通过术前化疗可客观评价肿瘤对化疗的反应，为患者术后的治疗提供依据;增强肿瘤细胞对放疗的敏感性，起到放疗增敏作用;提高中晚期宫颈癌的综合治疗效果。本研究发现化疗能显著降低survivin蛋白的表达率和表达量，明显提高肿瘤细胞凋亡率;缩小肿瘤的体积，降低淋巴结转移、宫旁浸润、脉管浸润、深肌层浸润和阴道浸润的比例，增加临床和病理的完全缓解率，提高患者的手术切除率，有利于提高Ⅰb～Ⅱa期患者的5年生存率，延长生存期。同时动脉灌注治疗与静脉化疗survivin阳性表达量下降量有统计学差异。Kuzuya[8]等针对局部晚期宫颈癌应用动脉灌注化疗，术后病检发现，其盆腔淋巴结转移率、宫旁转移率、血管间隙受侵率和阴道受侵率，均低于未行动脉灌注化疗者，其结果分别为：13.3%:54.2%、6.7%:43.8%、13.3%:60.4%、20%:41.7%，充分说明动脉灌注化疗不仅能有效缩小肿瘤的体积，使手术易于规范切除，而且还能消除或减少上述病理预后因素，提高患者的生存率，动脉灌注化疗加手术者的5年生存率为80%，而未行动脉化疗者仅为59.6%(P=0.004)。本研究发现化疗能显著降低survivin蛋白的表达率和表达量，明显提高肿瘤细胞凋亡率;化疗作为综合治疗宫颈癌的手段之一，越来越为广大医学专家所认同。化疗的近期疗效一般较显著，但是否能改善预后、提高生存率，尚需大宗病例回顾性分析，远期疗效有待进一步研究。不能把它作为宫颈癌的单独治疗，故应在化疗后肿瘤缩小的有利时机手术切除。化疗作为一种辅助的或根治性的治疗方法仍需大量的基础研究，包括化疗最佳用药途径和用药方式的研究、化疗药物选择的研究、动脉化疗栓塞治疗机制的研究、动脉化疗与动脉栓塞相结合的治疗机制以及相互关系的研究等等。

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