NKG2D介导NK细胞对鼻咽癌细胞杀伤作用的体外研究

　　作者：梅家转，郭坤元，魏红梅，常红，宋朝阳 作者单位：510282 广州，南方医科大学珠江医院血液科

　　【摘要】 目的 探讨鼻咽癌CNE2细胞表面HLAI类分子表型和NKG2D配体的表达情况，进一步了解其对同种异体NK细胞杀伤活性的影响。方法 流式细胞仪检测NKG2D的配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3在K562、CNE2细胞的表达情况。PCRSSP法分析CNE2细胞HLAA、B、Cw分型和NK细胞KIR分型。LDH释放法测定5例健康者NK细胞在不同效靶比时对K562、CNE2细胞的杀伤活性，效靶比20∶1时观察抗NKG2D配体的单抗对NK细胞杀伤K562、CNE2细胞活性的影响。结果 CNE2细胞表达MICA、MICB、ULBP2，不表达ULBP1、ULBP3。K562细胞表面表达MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3。5例健康者NK细胞抑制性KIR与CNE2细胞表面的HLAI类分子之间存在错配。效靶比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1时NK细胞对K562、CNE2细胞的杀伤活性分别为(29.02±0.45)%、(10.50±2.17)%;(44.43±1.36)%、(27.68±1.47)%;(57.82±1.35)%、(36.99±3.13)%;(71.24±2.36)%、(55.00±2.20)%,在各效靶比时NK细胞对K562细胞的杀伤活性较CNE2细胞明显增强(P=0.000);在效靶比20∶1时antiMICA、antiMICB、antiULBP1、antiULBP2、antiULBP3可明显抑制NK细胞对K562细胞的杀伤活性，与阻断前相比有显著性差异(P=0.000);antiMICA、antiMICB、antiULBP2可明显抑制NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性，与阻断前相比有显著性差异(P<0.01)，但antiULBP1、antiULBP3不能阻断NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性。结论 NKG2D配体影响NK细胞对靶细胞的杀伤活性，提高NKG2D配体的表达有可能提高NK细胞的抗肿瘤活性。

　　【关键词】 自然杀伤细胞;NKG2D;杀伤细胞免疫球蛋白样受体

　　NKG2D Mediated Cytotoxicities of NK Cells Against Human Nasopharyngeal Carcinoma Cell Line (CNE2) in Vitro

　　MEI Jiazhuan, GUO Kunyuan, WEI Hongmei, CHANG Hong, SONG Chaoyang

　　Department of Hematology, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510582, China　Corresponding Author：GUO Kunyuan，Email：gzyuan@pub.Guangzhou.gd.cn

　　Abstract：Objective To analyze HLA class I molecules and the expression of NKG2D ligands in human nasopharyngeal carcinoma cell line (CNE2) and their effects on cytotoxicity of natural killer (NK) cells. Methods The expression of NKG2D ligands on the surface of CNE2 and K562 cells were analyzed by flow cytometry. The HLA class I molecules in CNE2 cells and killer cell immunoglobulinlike receptors(KIR) expressed by NK cells (isolated from 5 healthy persons) were analyzed by PCRSSP. Cytotoxicities of NK cells against CNE2 and K562 cells were detected by LDH releasing assay at different effecttotarget cell ratios (E∶T). In blocking experiments, different antiNKG2D ligands monoclonal antibodies (mAbs) were added to the target cells at 20∶1 E∶T ratio. Results It was found that MICA, MICB, ULBP2 were expressed by CNE2, ULBP1, ULBP3 were not detectable on CNE2; K562 expressed all the NKG2D ligands. There were mismatches between inhibitory KIRs expressed by NK cells and HLA class I molecules expressed by the CNE2 cells. NK cells displayed highly in vitro cytotoxicity against K562 and CNE2 cells with anlysis of (29.02±0.45)%, (10.50±2.17)%; (44.43±1.36)%, (27.68±1.47)%; (57.82±1.35)%, (36.99±3.13)%; (71.24±2.36)%, (55.00±2.20)% respectively at 5∶1，10∶1, 20∶1, 30∶1 E∶T ratios(P=0.000). Blocking experiments confirmed that killing of K562 by NK cells was efficiently inhibited by antiMICA mAb, antiMICB mAb, antiULBP1 mAb, antiULBP2 mAb and antiULBP3 mAb. antiMICA mAb. Anti MICBmAb, antiULBP2 mAb could partially inhibit the cytotoxicity of NK cells against CNE2 cells, whereas antiULBP1 mAb and antiULBP3 mAb could not inhibit the cytotoxicity of NK cells. Conclusion Expression of NKG2D ligands is correlated with the cytotoxicity of NK cells. NK mediated cytolytic activity may be boosted by engineering cells expressing high levels of activating NKG2D ligands.

　　Key words：Natural killer cell; NKG2D; Killer cell immunoglobulinlike receptor

　　0 引言

　　NK细胞对靶细胞的杀伤活性与其细胞表面的受体和靶细胞表面的配体密切相关。NK细胞表面的抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Inhibitory killer cell immunoglobulinlike receptor,iKIR)与靶细胞表面特定的HLAI类分子结合可以明显抑制NK细胞的活性，靶细胞缺乏iKIR特定的配体将激发NK细胞对其杀伤活性 [1]。NKG2D为NK细胞的活化性受体，表达于所有的NK细胞表面，是介导NK细胞识别和溶解肿瘤细胞的主要活化性受体。NKG2D的配体为MHCI类链相关基因产物(MICA、MICB)及ULBPS(人巨细胞病毒UL16蛋白的结合蛋白ULBP1、ULBP2、ULBP3)，NKG2D的配体在多种肿瘤细胞表达，其在鼻咽癌细胞的表达尚未见报道。本研究主要探讨鼻咽癌CNE2细胞株HLAI类分子表型和NKG2D配体的表达情况，进一步了解其对同种异体NK细胞杀伤活性的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　NK细胞分离缓冲液(磷酸盐缓冲液，pH7.2，含0.5% BSA和2mM EDTA)及CD56 MicroBeads(Miltenyi Biotec公司)，FITC标记的山羊抗小鼠IgG1(eBioscience公司)，RPMI1640(Gibco公司)，淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)，rhIL2(上海华新公司)，NK细胞杀伤活性检测试剂盒(CytoTox96 NonRadioactive Cytotoxocity Assay，Promega公司)，KIR PCRSSP分型试剂盒(Dynal公司)，PCRSSPA、B、Cw特异性引物试剂盒(Biotest公司)，流式细胞仪(Coulter公司)，AMO1(antiMICA，IgG1)，BMO1(antiMICB，IgG1)，M295(antiULBP1，IgG1)，M310(antiULBP2，IgG1)，M551(antiULBP3，IgG1)，以上单抗由德国Alexander steinle及意大利Lorenzo Moretta教授惠赠。人鼻咽癌细胞株CNE2由军事医学科学院李春海教授惠赠 [2]，人慢性髓系白血病细胞株K562由本室冻存。

　　1.2 方法

　　1.2.1 NK细胞的分离纯化

　　采用常规密度梯度离心法分离5例健康人外周血单个核细胞，PBS洗涤2次，计数细胞，CD56 MicroBeads作细胞阳性分选,获得CD3-CD56+细胞，流式细胞仪检测CD3-CD16+CD56+细胞的纯度。

　　1.2.2 细胞培养

　　细胞培养基为含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640。培养NK细胞时加入1000U/ml的rhIL2。

　　1.2.3 K562、CNE2细胞表面NKG2D主要活化性配体的测定

　　收集对数期生长的K562、CNE2细胞，PBS洗涤后，计数细胞，分管，按1μg/106细胞浓度分别加入AMO1、BMO1、M295、M310、M551，4℃孵育30min，PBS洗涤3次，以FITC标记的山羊抗鼠IgG1二抗4℃孵育30min，PBS洗涤，同型IgG1(Pharmingen公司)作为阴性对照抗体，流式细胞仪分析样本中1×104个细胞中阳性细胞数，计算表达率。

　　1.2.4 CNE2细胞表面HLAA、B、Cw基因分型

　　采用PCRSSP法，按PCRSSPA、B、Cw特异性引物试剂盒说明操作。

　　1.2.5 KIR基因分型

　　采用PCRSSP法，按KIR基因分型试剂盒说明操作。

　　1.2.6 NK细胞杀伤活性测定

　　采用4h LDH释放测定法，参照CytoTox96 NonRadioactive Cytotoxocity Assay说明操作。抗体封闭试验以效靶比20∶1时AMO1、BMO1、M295、M310、M551各1μg分别与靶细胞室温孵育15min，然后再加入NK细胞测杀伤率。NK细胞杀伤活性(%)=(实验组OD平均值-靶细胞自然释放组OD平均值-效应细胞自然释放组OD平均值)/(靶细胞最大释放组OD平均值-靶细胞自然释放组OD平均值)×100%

　　1.3 统计学处理方法

　　应用SPSS10.0软件进行数据处理，采用独立样本t检验。

　　2 结果

　　2.1 NK细胞的纯度

　　流式细胞仪检测CD3-CD16+CD56+细胞的纯度达90%以上。

　　2.2 K562、CNE2细胞表面NKG2D的配体表达

　　本研究结果显示CNE2细胞表面MICA、MICB、ULBP1的表达率分别为(85.78±4.95)%、(55.13±2.21)%、(51.47±2.43)%，不表达ULBP1、ULBP3;K562细胞表面MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3的表达率分别为(57.12±1.12)%、(46.64±0.40)%、(43.50±0.93)%、(65.24±0.47)%、(53.96±1.24)%，见表1。表1 NKG2D的配体在K562、CNE2细胞表面表达的阳性细胞百分数(略)

　　2.3 CNE2细胞表面HLAA、B、Cw基因分型结果

　　CNE2细胞表面HLAA、B、Cw表型为A2,24;B18,35;Cw4,7。

　　2.4 KIR基因分型

　　5例健康人均表达KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2。

　　2.5 NK细胞杀伤活性

　　本研究结果显示NK细胞对K562、CNE2细胞的杀伤活性在效靶比5∶1时分别为(29.02±0.45)%、(10.50±2.17)%;效靶比10∶1时分别为(44.43±1.36)%、(27.68±1.47)%;效靶比20∶1时分别为(57.82±1.35)%、(36.99±3.13)%;效靶比30∶1时分别为(71.24±2.36)%、(55.00±2.20)%，在各效靶比时NK细胞对K562细胞的杀伤活性较CNE2细胞明显增强(P=0.000);效靶比20∶1时AMO1、BMO1、M295、M310、M551分别对K562细胞表面相应位点进行封闭,NK细胞对K562细胞的杀伤活性分别为(46.82±2.62)%、(49.26±0.98)%、(50.42±1.79)%、(50.75±1.23)%、(51.68±1.34)%和阻断前(57.82±1.35)%相比有显著性差异(P<0.01),见图1;效靶比20∶1时AMO1、BMO1、M310分别对CNE2细胞表面相应位点进行封闭,NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性分别为(27.07±2.87)%、(29.12±0.68)%、(27.71±3.18)%与阻断前(36.99±3.13)%相比有显著性差异(P<0.01);M295、M551对CNE2细胞表面相应位点进行封闭,NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性分别为(36.67±3.27)%、(36.75±2.53)%，与阻断前相比无明显变化(P>0.05),见图2。

　　3 讨论

　　NK细胞是机体内重要的淋巴细胞亚群, 在肿瘤免疫中NK细胞构成了第一道杀伤防线。NK细胞表面的抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(iKIR)与靶细胞表面特定的HLAI类分子结合可以明显抑制NK细胞的活性，靶细胞缺乏iKIR特定的配体(KIR配体错配)将激发NK细胞对靶细胞的杀伤活性 [1]。不同的iKIR分子识别并结合不同的HLAI类分子。KIR2DL1识别HLACw2、Cw4、Cw5、Cw6;KIR2DL2/2DL3识别HLACw1、Cw3、Cw7、Cw8 ;KIR3DL1识别HLAB w4;KIR3DL2识别HLAA3、A11;其余的KIR配体尚未明确 [3]。KIR2DL1、KIR2DL2/2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2是目前已知的影响NK细胞同种异体反应性的主要抑制性受体 [1]。

　　NKG2D是1991年Houchins等在NK细胞中发现的，NKG2D除表达在所有NK细胞上外，在绝大多数γδT 细胞、CD8 +αβT细胞上也有表达 [4]。人NKG2D的配体分为两大类：第一类包括MICA、MICB，属于非经典的HLAI类基因，集中表达于胃肠道上皮细胞表面，在大多数上皮性肿瘤细胞如肺癌、乳腺癌、肾癌及卵巢癌、结肠癌肿瘤组织中也有表达。第二类人NKG2D 配体由ULBP1、ULBP2、ULBP3 组成，均带有MHC样α1、α2 结构域，并通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞表面，其表达较广泛，可以表达于多种细胞、组织、肿瘤，是NKG2D发挥杀伤活性的主要配体。

　　研究表明，由于肿瘤细胞的MHCI类分子丢失或变异， 使得特异性MHC限制性的细胞毒T细胞不能发挥作用，在这种情况下，识别非MHCI类分子的NKG2D在介导NK细胞识别和溶解肿瘤细胞的免疫反应中发挥关键作用 [5]。NKG2D通过与靶细胞表面诱导产生的相应配体结合，然后结合转接蛋白向NK细胞传递活化信号，使NK细胞获得攻击靶细胞的能力，另外还可能为CD8 +T细胞提供必要的协同刺激信号。在很大程度上NKG2D的活化决定了机体的抗肿瘤细胞免疫水平。

　　本研究表明CNE2细胞表达MICA、MICB、ULBP2，不表达ULBP1、ULBP3;CNE2细胞表面HLAA、B、Cw表型为A2，24、B18，35、Cw4，7，不表达BW4、A3、A11分子，因此5例健康个体体内表达KIR3DL1、KIR3DL2的NK细胞与CNE2细胞之间存在KIR配体错配现象。有研究表明94%个体表达KIR3DL1，KIR3DL2为NK细胞的框架基因，任意个体的NK细胞均表达KIR3DL2 [6]，因此任意个体的NK细胞均与CNE2细胞之间存在着KIR配体错配现象，结合NKG2D配体的检测结果表明任意个体的NK细胞都存在杀伤CNE2细胞的分子基础。本研究显示NK细胞对CNE2细胞有较高的杀伤活性，antiMICA、antiMICB、antiULBP2均可不同程度地抑制NK细胞对CNE2的杀伤活性，说明NKG2D在NK细胞杀伤CNE2细胞中起主导作用。

　　K562细胞不表达HLAI类分子，因此任意个体的NK细胞都与之存在KIR配体错配现象，本研究结果表明K562细胞表达MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3。NK细胞对K562细胞具有较高的杀伤活性，antiMICA、antiMICB、antiULBP1、anti ULBP2、antiULBP3均可不同程度地抑制NK细胞对K562细胞的杀伤活性，说明NK细胞杀伤K562细胞通过NKG2D发挥作用。

　　研究表明 [79]，肿瘤细胞表面NKG2D配体在体内存在膜型和可溶性两种形式，可溶性NKG2D配体与NKG2D的结合可诱导T、NK细胞表面NKG2D的内化和降解，下调NKG2D表达，进而严重损害肿瘤抗原特异性T细胞效应，同时削弱NK细胞的活性，促进肿瘤免疫逃逸。鼻咽癌患者体内是否存在高浓度的可溶性NKG2D配体，能否作为患者的临床预后指标，值得我们进行进一步深入研究。

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