胃肠道间质瘤中pERK和PTEN的表达及相互关系

　　作者：张天彪， 赵滢， 关一夫 作者单位：(中国医科大学基础医学院 生物化学与分子生物学教研室， 辽宁 沈阳 110001;中国医科大学附属盛京医院 胃肠外科， 辽宁 沈阳 110004) 辽宁省教育厅科研基金资助项目(2009A726)。

　　【摘要】 目的： 研究胃肠道间质瘤(GIST)中pERK和PTEN蛋白的表达，并探讨二者之间的关系。方法: 采用免疫组织化学方法检测124例GIST患者及癌旁正常组织中pERK和PTEN的表达水平，并进行比较分析。结果: GIST组织中pERK蛋白表达阳性率84.68%，明显高于正常组织(16.13%);PTEN蛋白表达的阳性率60.48%，明显低于正常癌旁组织(100%)，差异有显著性(P<0.01);pERK和PTEN的表达与性别、年龄以及组织学类型无关，与NIH分级、淋巴结转移及浸润深度有关;pERK与PTEN表达呈负相关。结论: pERK的高表达、PTEN的低表达共同促进了GIST的发展。

　　【关键词】 胃肠肿瘤; 有丝分裂素激活蛋白激酶激酶类; 基因，肿瘤制; PTEN

　　Expressions of pERK and PTEN in Gastrointestinal Stromal Tumors and Their Interrelation

　　ZHANG Tianbiao1, ZHAO Ying2, GUAN Yifu1

　　(Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Basic Medicine, China Medical University, Shenyang 110001，Liaoning, China;The Affiliated Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning, China)

　　[Abstract] Objective: To investigate the expression of pERK, and PTEN proteins in gastrointestinal stromal tumors (GIST) and their interrelation. Methods: pERK and PTEN expressions in GIST and normal tissues of 124 patients were detected by using immunohistochemistry method, and the results were analized. Results: The positive rate of pERK protein expression in GIST tissue (84.68%) was significantly higher than that in normal tissues (16.113%), while the positive rate of PTEN protein expression in GIST tissue (60.48%) was lower than that in normal tissue (100%) with statistically significance (P<0.01); Expressions of pERK and PTEN appeared to relate to NIH grading, lymphonode metastasis, and infiltration depth, but not to gender, age or tissue types. Expression of pERK and PTEN showed a negative correlation to each other. Conclusions: High expression of pERK, together with low expression of PTEN, propels the development of GIST, which may throw light to development of new antitumor drug and clinical tumor therapy.

　　[Key words] gastrointestinal neoplasms; mitogenactivated protein kinase; genes, tumor suppressor; PTEN

　　细胞外信号调节激酶(ERK)定位于染色体1p34～35[1]，是Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的重要成分，也是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成员之一。磷酸化的ERK(pERK)是ERK的活化形式，可介导信号由胞浆向胞核传递，参与调节细胞的生长、发育、分化、分裂等多种生理过程，并在细胞的恶性转化中起重要作用[2]。PTEN是一种肿瘤抑制基因，在细胞非黏附状态下，对肿瘤抑制功能起重要调控作用[3]。PTEN基因的突变，失去了对细胞生长的负调控，导致肿瘤发生。PTEN是最易发生突变的靶点基因之一，其突变频率与p53相当[4]。研究表明，PTEN能通过脱磷酸化作用调控多种细胞内信号传导通路，从而调节细胞正常的生长、发育及抑制肿瘤细胞增殖、黏附、转移[5]，胃肠道间质瘤(GIST)组织中PTEN对ERK信号通路的调控国内很少有文献报道。GIST是胃肠道独立的间叶源性肿瘤，占胃肠道肿瘤的0.1%～3.0%，缺乏特异性临床症状及体征[6]。2009年4月～2009年10月，采用免疫组织化学法检测pERK和PTEN在GIST中的表达，并探讨其临床意义，为肿瘤预防和临床诊断治疗提供依据。

　　1 资料与方法

　　1.1 临床资料

　　选择1991年-2009年临床病理资料完整、随访结果确切、经手术切除、病理证实的GIST新鲜组织标本124例作为GIST组，男64例、女60例，年龄9～79岁、平均54.6岁。肿瘤发生于胃62例、小肠28例、结直肠14例、食管9例、胃肠道外11例(网膜4例、肠系膜4例、后腹膜3例)。取癌旁正常组织作为对照组。

　　1.2 试剂及仪器

　　兔抗人pERK多克隆抗体(Rabbit antipERK:SC7383)、鼠抗人PTEN单克隆抗体(Mouse antiPTEN:SC7974)购自Santa Cruz公司，HRP标志的第二抗体购自北京中杉公司，DAB显色底物购自Takara公司，其他试剂为国产分析纯。OlympusBX41显微镜、显微数码照相机OlympusBX40F4等，由中国医科大学附属盛京医院病理科提供。

　　1.3 方法

　　切除病变组织经10%福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm连续切片，分别进行HE染色和免疫组织化学SP染色，以PBS代替一抗作阴性对照。

　　1.4 结果判断

　　光镜下以胞核及胞浆内棕黄色颗粒为阳性细胞。先于低倍镜下观察，排除肿瘤坏死出血区及边缘反应区，于肿瘤内染色相对密集区选择5个视野分别进行细胞记数，高倍镜下进行观察阳性细胞数:无阳性细胞记0分，≤25%记为1分，26%～50%记为2分，51%～75%记为3分，>75%记为4分。染色强度为0～3分:无色记为0分，浅黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分。将两项指标评分相乘，根据总分分为四级:阴性(-)为0分，弱阳性(+)为1～2分，阳性(++)为3～4分，强阳性(+++)为>4分。

　　1.3 统计学方法

　　每组实验重复3～4次，实验结果应用SPSS 13.0统计软件进行分析，以P≤0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　pERK蛋白染色阳性反应信号呈棕黄色细小颗粒，主要位于细胞核内，部分位于细胞浆，GIST组织中pERK蛋白表达阳性率84.68%(105/124)，明显高于癌旁正常组织16.13%(20/124)，差异有显著性(P<0.01)，见图1。PTEN蛋白染色阳性反应信号呈棕黄色细小颗粒，主要位于细胞浆中，部分位于细胞核，GIST中PTEN蛋白表达的阳性率60.48%(75/124)，明显低于癌旁正常组织100%(124/124)，差异有显著性(P<0.01，图2)。PTEN蛋白和pERK蛋白的表达与肠道间质瘤临床病理特征之间的关系，见表1。表1 pERK和PTEN表达与临床病理学特征的关系(略)

　　3 讨论

　　癌变是正常细胞分化异常、增殖过度及凋亡受阻的结果[7]，细胞信号传导通路的异常在这些过程中起着重要作用。一些生长因子、细胞因子及肿瘤启动子通过Ras/Raf/MEK/ERK途径磷酸化激活ERK，活化的ERK(PERK)将胞浆内信号导入胞核，作用于cjun、cfos、cMyc、Elk1等转录因子及核蛋白，促进多种癌基因及细胞周期调节相关基因的转录与表达[8]。本文研究结果显示，组织pERK蛋白表达阳性率(84.2%)明显高于相应正常组织(12.3%，P<0.05)，提示ERK过度激活可能在GIST的发生中起重要的作用。研究还发现，随着浸润深度的增加，pERK蛋白表达的阳性率增高(P<0.05)，伴淋巴结转移者PERK蛋白表达的阳性率较无转移者高(P<0.01);随NIH分级，GIST组织pERK蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，说明pERK蛋白过表达在GIST浸润、转移等过程中起到了促进作用。

　　124例GIST组织中，pERK和PTEN蛋白表达呈负相关(r=-0.401，P=0.018)。近来研究发现，PTEN参与多种细胞信号转导通路的调节，本文研究结果显示，PTEN的表达与pERK的表达呈负相关(P<0.05)，说明PTEN蛋白能有效抑制ERK信号通路的激活。GIST组织中PTEN蛋白表达的阳性率60.48%明显低于癌旁正常组织100%，差异显著(P<0.01)，提示PTEN缺失或突变与GIST的发生有关。本实验证实，浸润程度越深，PTEN蛋白表达的阳性率越低，伴淋巴结转移者PTEN蛋白表达的阳性率较无转移者低(P<0.05)，随NIH分级GIST组织PTEN蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，说明PTEN蛋白表达降低与GIST的生物学行为和预后密切相关。本研究提示，在GIST的发生、发展过程中，PTEN的低表达或失表达，导致ERK所介导的信号通路异常激活，使细胞异常增殖及恶性转化，并促进肿瘤浸润、转移。因此，在GIST组织中，PTEN基因具体通过哪一种途径调节ERK信号通路，还有待进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1]　Loesch M, Chen G. The p38 MAPK stress pathway as a tumor suppressor or more[J].Front Biosci,2008(13):3581-93.

　　[2]　Steelman LS, Abrams SL, Whelan J, et al. Contributions of the Raf/MEK/ERK, PI3K/PTEN/Akt/mTOR and Jak/STAT pathways to leukemia[J].. Leukemia,2008(4):686-707.

　　[3]　Nezhat F, Datta MS, Hanson V, et al. The relationship of endometriosis and ovarian malignancy a review[J].Fertil Steril,2008(5):1559-1570.

　　[4]　Yin Y, Shen WH. PTEN: a new guardian of the genome[J].Oncogene,2008(41):5443-5453.

　　[5]　Wang X, Jiang X. PTEN: a default gatekeeping tumor suppressor with a versatile tail[J].Cell Res,2008(8):807-816.

　　[6]　Singer S, Rubin BP, Lux ML, et al. Prognostic value of KIT mutation type, mitotic activity, and histologic subtype in gastrointestinal stromal tumors [J]. J Clin Oncol, 2002(18):3898-3905.

　　[7]　Lai JP, Sandhu DS, Shire AM, et al. The tumor suppressor function of human sulfatase 1 (SULF1) in carcinogenesis[J].J Gastrointest Cancer,2008(1-4):149-58.

　　[8]　Muslin AJ. MAPK signalling in cardiovascular health and disease: molecular mechanisms and therapeutic targets[J].Clin Sci (Lond),2008(7):203-218.