老年肺癌病人痰标本中p16基因异常甲基化的研究

　　作者：李虹 郑世营 蒋东 刘顺寿 孙楠

　　【摘要】 目的 分析老年肺癌病人痰标本中p16基因启动子区域异常高甲基化的改变情况,评价该指标作为肺癌辅助诊断分子标记物的价值。 方法 运用半巢式甲基化特异性聚合酶链反应技术,检测94例老年原发性肺癌病人痰标本和部分对应肿瘤组织,以及10例慢性肺炎病例痰标本中p16基因启动子区域的甲基化改变。 结果 74%的肺癌病人痰标本中检测到了p16基因异常高甲基化,与传统细胞学(46.8%)相比,痰标本中p16基因异常高甲基化对肿瘤的检出率(74.5%)灵敏度更高(P<0.01);痰细胞中p16甲基化检测和细胞学相结合,对肿瘤的检出率可达86.17%(81/94)。如果痰标本中p16基因启动子区域发生高甲基化,其对应的肿瘤组织中p16基因亦为高甲基化。10例慢性肺炎病人痰标本中仅3例检测出p16基因甲基化。 结论 痰标本中p16基因甲基化是临床肺癌辅助诊断的有效分子生物标记物之一。

　　【关键词】 肺癌; p16基因; DNA甲基化; 痰; 老年人

　　我国肺癌的发病率和死亡率一直呈上升趋势,严重危害人民的健康和生命。因此，降低肺癌死亡率的策略主要在于早期发现、早期诊断和早期治疗,其中早期诊断又是提高治疗效果的关键。随着对肺癌发生、发展过程中分子遗传学机制的认识,人们开始注意利用有效的分子生物标记进行肺癌辅助诊断的研究[1]。DNA异常甲基化是人类肿瘤中常见的改变,且广泛参与了肿瘤的发生、发展过程。研究表明，分析DNA异常甲基化并作为分子生物标志物,在肿瘤的诊断、治疗和预后中均显示出广阔的应用前景[2]。国内有作者运用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific PCR,MSP)技术,分析了137例肺癌病人血浆和对应肿瘤标本中p16基因启动子区域的异常甲基化情况,结果表明在血浆和肿瘤组织中的p16基因甲基化检出率均较高;而且,只有肿瘤组织中存在p16甲基化的病例其对应的血浆标本能检测出这一改变,提示p16基因异常甲基化可能是肺癌辅助诊断的有效生物标志物之一[3]。相对于血浆标本,痰标本的采集具有取材更为方便、无创性和病人易于接受等优点,是进行高危人群大规模筛选和肺癌辅助临床诊断更好的取材方式。为此,我们对老年肺癌病人痰标本中p16基因异常甲基化情况作一分析。

　　1 材料和方法

　　1.1 临床标本收集 痰标本取自苏州大学附属第一医院胸外科2005年5月至2006年4月间收治的老年原发性肺癌病人,共94例，年龄≥60岁，其中男61例，女33例，年龄60～81岁，平均(68±3)岁。其中鳞癌(squamous cell carcinoma,SCC)42例、腺癌(adenocarcinoma,ADC)31例、小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)12例、腺鳞癌(adenosquamous carcinoma,ASC)7例、大细胞肺癌(large cell lung cancer,LCLC)2例;部分对应的肿瘤组织53例;10例老年慢性肺炎病人，男6例，女4例，年龄60～78岁，平均(66±2)岁。痰标本取自该院呼吸科住院病人。所有标本均有确切的组织病理学诊断。痰标本由医院检验中心临床细胞学室处理：经ThinPrep系统的CytoLyt溶液处理15 min,1000 r/min离心收集细胞;PBS洗2次,细胞置-20 ℃保存。病人的痰标本均取自术前,在术后收集相应的肿瘤组织标本,置-80 ℃保存。

　　1.2 DNA提取 肿瘤组织微切割以及DNA的提取参照文献进行[3]。痰细胞DNA提取根据细胞量的多少加入消化液(10 mmol/L TrisHCl, 50 mmol/L KCl, 0.1% TritonX, 0.2 mg/ml蛋白酶K)200～500 μl,55 ℃水浴3 h或37 ℃水浴24 h,95 ℃变性蛋白酶K 10 min,冷却后12 000 r/min离心10 min,取上清液置-20 ℃保存。

　　1.3 p16基因异常甲基化检测

　　1.3.1 基因组DNA亚硫酸氢钠处理以及PCR体系：参照相关文献方法进行[4]。

　　1.3.2 半巢式甲基化特异性PCR：PCR引物序列参照Herman 等[4]的设计由上海生工公司合成。第1次PCR引物为p16MS/p16MAS2,PCR反应退火温度为64 ℃;取第1次PCR反应产物5 μl,以p16MS和p16MAS1为引物,进行第2次扩增,PCR反应退火温度为67 ℃。

　　所有标本均进行了p16基因非甲基化检测,第1次PCR反应引物为p16US/p16UAS2,第2次PCR反应引物为p16US/p16UAS1。PCR反应体系同前,反应退火温度分别为58 ℃和62 ℃。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,凝胶图像分析系统记录数据。每一样品PCR扩增至少重复1次。前列腺癌细胞株TSUPR1基因组DNA作为p16基因甲基化检测的阳性对照[5]。

　　1.4 统计学分析 利用SPSS软件进行χ2检验，P<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　在94例肿瘤病人痰标本中,p16基因高甲基化总体检出率为74.5%,如果以此作为肿瘤诊断的标志,与传统细胞学相比(46.8%),差异显著(P<0.01),说明p16基因甲基化作为分子诊断的标志物具有较高的灵敏度,见表1。除SCLC外,在SCC、ADC和ASC痰标本中p16基因甲基化检出率均显著高于传统的细胞学诊断率(P<0.01),见表1。在10例病理学诊断为慢性肺炎的病人中,仅3例痰标本中检出p16基因的甲基化改变。表1 老年肺癌病人痰标本中p16基因甲基化检测及细胞学诊断敏感度比较注：与p16基因甲基化比较，** P<0.01 在不同类型的肿瘤中,痰标本中p16基因甲基化异常检出率均较高,说明肺癌病人痰细胞中p16基因的异常改变是一个普遍的现象,在SCC和ADC痰标本中,p16基因甲基化在前者中较高,但差异不显著。见表1。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ/Ⅳ期SCC病人痰标本中p16基因甲基化检出率很接近,而细胞学对肿瘤的检出率在晚期SCC病人中较高。见表2。

　　我们分析了53例对应肿瘤组织p16基因甲基化发生情况,总体上看,痰标本中p16甲基化呈阳性的病例其对应的肿瘤组织中p16基因也发生高甲基化。此外,通过对所有转化后的DNA样品进行p16非甲基化分析,发现全部样品均有非甲基化PCR产物,表明DNA的亚硫酸氢钠修饰是成功的。痰标本中p16基因甲基化电泳图见图1。表2 老年SCC病人各临床分期痰标本和肿瘤组织中p16基因甲基化检测及细胞学诊断结果比较注：与p16基因甲基化(第2次PCR)比较，** P<0.01 M: DNA marker; TSU: TSUPR1, 前列腺癌细胞阳性对照;

　　3 讨论

　　研究表明,痰细胞中出现的分子细胞学异常在对应的肿瘤组织中均可检测到。同时,在少数前瞻性的研究中,具有痰细胞分子细胞学异常改变的非肺癌病人,一般均可能发展成为肺癌[6]，这无疑为利用痰细胞进行肺癌分子诊断奠定了基础。

　　p16基因是细胞周期的负调控因子,通过与细胞周期蛋白竞争性结合CDK4和CDK6,阻止Rb磷酸化失活,从而参与细胞周期负调控。研究表明,p16基因的异常改变参与了多种肿瘤的发生[7]。

　　本研究结果显示，p16基因甲基化在肺癌病人痰标本中具有较高的检出率,痰标本中p16基因甲基化的病例,其对应的肿瘤组织中p16基因也处于甲基化状态,表明痰细胞中p16甲基化改变源于肿瘤细胞。在10例慢性肺炎病人的痰标本中,仅3例发现有p16基因甲基化改变。刘明等[2]研究表明,p16基因在慢性吸烟者支气管上皮细胞和肺癌癌前病变中就已经存在高甲基化;甚至在临床发现肿瘤5～35月之前,患者的痰细胞中就能检测出p16基因异常甲基化。因此我们研究中发现3例有p16基因甲基化的肺炎病人发展成为肺癌的可能性极大,我们也将进一步定期监测。如果将p16基因甲基化在痰标本中的检出率作为肺癌诊断的分子指标,与传统的细胞学指标相比,其灵敏度有显著增加。如果将痰细胞中p16甲基化检测和细胞学诊断相结合,对肿瘤的检出率可达86.17%(81/94);进一步结合血浆p16甲基化检测数据,则可发现92.15%(47/51)的肿瘤病人,因此p16基因甲基化检测是辅助肺癌诊断的有力手段。

　　本研究表明,p16基因甲基化在肺癌病人的痰中有很高的阳性率,是肺癌辅助诊断的候选标志物之一。

　　【参考文献】

　　[1] 郑秀立，孙蔚莉.重现老年肿瘤的防治[J].实用老年医学，2001，15(3)：15.

　　[2] 刘明，刘俊峰，刘兵，等.痰标本p16和MGMT基因甲基化对肺癌的诊断价值[J].肿瘤，2006，26(11)：10201023.

　　[6] 郭秀娟，沈莉. 痰标本p16基因启动子区甲基化联合血清细胞角蛋白19片段和癌抗原153对非小细胞肺癌的诊断价值[J]. 临床荟萃，2008，23(15):10671070.