SYBRGreen实时荧光RTPCR检测痰脱落细胞中MAGE mRNA的表达

　　作者：夏大文 唐艳 万敏 李亚荣 曲荣峰 石光 孙艳 刘晓霞 作者单位：吉林大学第二医院肿瘤内科,吉林 长春 130041

　　【摘要】目的 探讨肺癌患者痰液中黑色素瘤抗原基因MAGE mRNA的表达及其对肺癌早期诊断的意义。方法 建立以MAGE基因A1A6亚型通用引物进行 SYBRGreen实时荧光RTPCR的检测方法，并应用其检测14例肺癌病人和11例肺良性疾病病人痰液中MAGE基因 mRNA的表达。结果 14例肺癌病人中6例检测到痰液脱落细胞中有MAGE基因mRNA表达,检出率42.9%(6/14);在对照组肺良性病变者中未检测到MAGE基因mRNA的表达，两组差异有统计学意义(P<0.05)。另外，该法检出率大于痰液脱落细胞的细胞学检查检出率 21.4%(3/14),但无统计学差异(P>0.05)。结论 MAGE A1A6亚型基因的 mRNA可作为检测肺癌患者痰液的肿瘤标记物，SYBRGreen实时荧光RTPCR检测痰脱落细胞中MAGE mRNA可能有助于提高肺癌的检出率。

　　【关键词】 肺肿瘤;MAGE;RTPCR

　　笔者根据文献采用MAGE A1A6亚型通用引物通过巢式RTPCR法在痰液中检测MAGE mRNA的表达，取得较好进展，提高了肺癌细胞的检出率〔1〕。荧光实时PCR技术具有敏感性高、重复性好、速度快和污染少等优点〔2〕，目前尚未见以MAGE A1A6亚型通用引物通过SYBRGreen实时荧光RTPCR检测痰液脱落细胞中MAGE mRNA表达的报道。本文采用SYBRGreen荧光实时RTPCR技术，对14例肺癌患者痰标本脱落细胞中的MAGE mRNA进行了检测，同时探讨其对肺癌的辅助作用。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象

　　我院收治的14例肺癌患者，均经病理科确诊，男8例，女6例，年龄26～76岁，平均年龄56.3岁。11例肺良性疾病病人(肺结核6例、支气管炎5例)作为阴性对照。病理类型为鳞癌4例，腺癌8例，小细胞未分化癌1例，细支气管肺泡癌1例。肿瘤TNM分期为Ⅰ期1例,Ⅱ期3例,Ⅲ期7例,Ⅳ期3例。痰液脱落细胞细胞学检查参见我院病理科脱落细胞室诊断报告。

　　1.2 方法

　　1.2.1 试剂

　　Trizol试剂为invitrogen公司产品;AMV 逆转录酶等逆转录试剂购自promega公司;DNA Tag酶及pMD18T 载体购自北京鼎国生物化学公司;20 ×SYBR GreenⅠ染料为OPE公司产品。引物由上海生工生物技术有限公司合成。

　　1.2.2 痰液采集及处理

　　采集每例入选者治疗前自然咯出痰及诱导痰液共5 ml。痰液采集方法如下:于超声雾化器雾化杯中加入4%的NaCl溶液10 ml，吸入高渗盐溶液15～25 min，嘱病人漱口，用力咯出深部痰。痰液处理方法：合格痰中加入4倍体积0.3%二硫苏糖醇(DTT)充分混合，将痰液置37℃水浴10 min，分置于5个试管,以1 000 r/min离心5～10 min，收集沉淀,每管加入Trizol 1 ml,用一次性注射器进行反复抽打形成清亮不黏稠的液体,-70℃冻存。

　　1.2.3 RNA提取

　　Trizol一步法进行细胞总RNA的抽提。用无RNA 酶的DNA酶Ⅰ处理，以提高RNA纯度。

　　1.2.4 RTPCR扩增及cDNA合成

　　逆转录反应在10 μl反应混合物中进行，包括 50 mmol/L Tris HCl，75 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2,0.1 mmol/L dNTP,0.5 μmol/L特异性引物，5 U的AMV逆转录酶及提取的全部RNA，合成条件为45℃ 45 min。特异性引物序列参见文献〔3〕。上游：5′CTGAAGGAGAAGATCTGCC3′,下游：5′CTCCAGGTAGTTTTCCTGCAC3′。

　　1.2.5 参比模板质粒构建

　　以RTPCR一步法获得的PCR产物(巢式PCR扩增MAGE基因首轮PCR产物)纯化后，克隆至pMD-18 T载体，扩增、质粒提取及进行cDNA序列测定(北京赛百盛公司)〔1〕。

　　1.2.6 实时荧光PCR反应及标准曲线绘制

　　根据文献〔3〕设计上、下游引物,分别为上游：5′CTGAAGGAGAAGATCTGCCWGTG3′,下游：5′CCAGCATTTCTGCCTTTGTGA3′，扩增片段长度为469～493 bp。扩增体积20 μl，分别加入0.5 μmol/L的引物，0.2 mmol/L dNTP浓度，2.0 mmol/L MgCl2,0.6 U Tag DNA合成酶，20 ×SYBRGreenⅠ0.5 μl 及10 μl cDNA。扩增条件为:95℃ 5 min,95℃ 15 s,60℃30 s,72℃30 s，循环40次。提取参比模板质粒，紫外分光光度计检测质粒A260 nm吸光度值,根据质粒分子量计算质粒浓度，定量后将重组质粒标准品原液按梯度稀释成2.5×107、2.5×106、2.5×105、2.5×104、2.5×103、2.5×102，2.5×101拷贝/μl,分别取每一数量级稀释液2 μl作为PCR模板。同时设立以水和空载质粒为模板(即靶基因拷贝为0)的对照反应。将实时定量RTPCR产物从50℃缓慢而均匀地升温至10℃，温度每升高0.2℃读一次荧光值，每2次读值间隔1 s。反应结束，由实时荧光定量PCR仪(罗氏light Cycler 2.0)自动绘制熔链曲线。

　　1.3 统计学分析

　　率的比较采用χ2检验和Fisher′s Exact检验。

　　2 结 果

　　2.1 SYBRGreen荧光实时RTPCR检测方法建立

　　将报道的首轮PCR 产物与pMD18T 载体连接后,转化大肠杆菌得到重组质粒，PCR 法和酶切鉴定阳性克隆,可观察到约850 bp大小的特异性扩增条带(图1)。经测序后证实序列正确。把不同稀释度的参比模板同时进行定量PCR检测,用Ct 值与其对应的不同定量模板的对数拟合作图，得出一条定量标准曲线。在(101～107)拷贝/ml范围内,Ct 值与起始模板浓度具有良好的线性关系，相关系数>0.990,见图2。用该法对11例肺良性疾病病人痰检测,发现有2例检测结果在101数量级,其余9例未能检测到。因此,设定检测结果低于102个拷贝数量级为阴性标本。 反应结束后,仪器自动进行了熔解曲线分析,温度峰值与预期Tm值一致,特异性扩增产物熔解温度均一、峰形锐利。

　　2.2 SYBRGreen荧光实时RTPCR检测MAGE表达结果

　　14例肺癌患者中,6 例(42.9%)检测到MAGE mRNA的表达,在对照组11例良性病人均无阳性结果,两组差异有统计学意义(Fisher′s Exact检验,P<0.05)。其肺癌检出率大于痰液脱落细胞细胞学检查检出率 21.4%(3/14),但差异无统计学意义(P>0.05)。

　　3 讨论

　　SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR 是近年出现的高特异、高灵敏的定量PCR方法〔4〕。在PCR反应体系中，加入过量SYBRGreen Ⅰ荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，荧光信号增强，而不掺入链中的SYBRGreen Ⅰ染料分子荧光不变，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。荧光可以在退火阶段或者延伸阶段测定。当信号达到一定的阈值,此时的循环次数(Ct 值) 被记录下来，Ct 值和PCR 反应体系中起始DNA或cDNA 量的对数值有严格的线性关系,从而达到定量的目的。本研究利用既往研究中已获得的巢式PCR首轮PCR产物T载体克隆质粒做为参比模板，然后建立了该重组质粒的标准曲线，结果显示，在(101～107) 拷贝/ml范围内,Ct 值与参比模板浓度具有良好的线性关系(r>0.990)。

　　与TaqMan法相比，SYBRGreen Ⅰ法无需另外设计荧光探针，无需特别优化条件，简便易行，成本较低，能适用于任何一款定量PCR仪，与普通PCR 相比，SYBRGreen 实时荧光定量PCR 不需要PCR 后续的电泳步骤，减少了污染的可能性。然而正是由于荧光染料能和任何双链DNA结合，因此它也能与DNA引物二聚体或其他非特异扩增产物结合,使试验容易产生假阳性信号。但通过严格控制引物质量、纯化模板和设计对照，能很好地解决假阳性信号。本实验通过溶解曲线可以看到避免了引物二聚体的产生，具有很高的特异性。另外，良性疾病对照标本中均未检测到MAGE基因的表达,也说明所采用的方法具有特异性。

　　黑色素瘤抗原基因MAGE是一种特异性很高的肿瘤特异性抗原，仅特异高表达于癌组织，如肺癌、胃癌、食管癌等，但在正常组织(胎盘和睾丸组织除外)不表达或微量表达〔5〕。其每一种亚型在癌组织中的单独表达率均较低，但MAGE A1A6 6种亚型在恶性肿瘤组织的共同表达率却很高〔3〕。采用MAGE A1A6通用引物及巢式RTPCR检测肺癌患者痰液中MAGE基因的表达，文献报道可获得41.8%(随机痰)及72.7%(诱导痰)的检出率〔6〕。本组在既往研究中由于受到检测试剂及样本例数等的限制,仅获得30.4%(4/23)的检出率(随机痰或诱导痰)〔1〕。在本研究中，采用SYBRGreen荧光实时RTPCR技术，使MAGE基因在肺癌患者痰液中表达的检出率升高至(42.9%)，本实验采用的痰液为诱导痰，大于笔者既往报道在混合痰中的MAGE基因检出率，但低于文献报道的检出率。关于采用两种技术方法所获得的检出率的比较有待进一步研究。良性疾病对照标本中未检测到MAGE基因的表达,说明本研究所采用的方法具有特异性。

　　本组结果表明MAGE A1A6亚型基因的 mRNA可作为检测肺癌患者痰液癌细胞的标记物，应用SYBRGreen实时荧光RTPCR对痰脱落细胞中MAGE mRNA表达的检测可能有助于提高肺癌检出率。

　　【参考文献】

　　1 唐 艳,夏大文,李亚荣,等.以MAGE A1A6亚型基因mRNA为特异标记检测肺癌细胞〔J〕.中国老年学杂志，2008;28(21)：21235.

　　2 Klein D.Quantification using realtime PCR technology：applications and limitations〔J〕.Trends Mol Med,2002;8:25760.

　　3 Park JW，Kwon TK，KimIH,et al.A new strategy for the diagnosis of MAGEexpressing cancers〔J〕.J Immunol Methods,2002;266:7986.

　　4 Aldea C，Alvarev CP，Folgueira L,et al.Rapid detection of herpes simplex virus in genital ulcers by real time PCR using SYBR Green dye as the detection signal〔J〕.J Clin Microbiol，2002;40：106062.

　　5 Fang JB，Wang L.The function of tumor specific antigen (MAGE) in tumor immunotherapy〔J〕.Sheng Li Ke Xue Jin Zhan,2005;36(3):27375.

　　6 Jheon S，Hyun DS，Lee SC,et al.Lung cancer detection by a RTnested PCR using MAGE A16 common primers〔J〕.Lung Cancer,2004;43:2937.