131I- Rituximab对B细胞淋巴瘤生物学效应的实验研究

　　作者：蔡秋琼，杜明华，陈宝安，钟英，黄科，屈海船 作者单位：东南大学 临床医学院，江苏 南京 210009

　　【摘要】 目的:研究131I标记的Rituximab对B细胞淋巴瘤细胞的生物学效应以及对荷人Raji细胞移植瘤裸鼠的放射免疫治疗效果，为放射免疫导向治疗提供实验依据。方法：体外培养人B细胞淋巴瘤细胞系Raji细胞，裸鼠皮下接种Raji细胞成瘤，IODO- GEN法将131I标记于Rituximab，将细胞分为131I- Rituximab组、单纯抗体组、单纯核素组及空白对照组4组，流式细胞仪检测各组Raji细胞凋亡和细胞周期;取30只成瘤裸鼠随机分成高、中、低剂量治疗组及单纯抗体组、单纯核素组、空白对照组6组，进行裸鼠的放射免疫治疗研究。每周测量裸鼠荷瘤大小1次,4周后处死裸鼠,取瘤称重，常规病理分析。结果：131I- Rituximab组凋亡率高于其他各组;131I- Rituximab组细胞周期发生变化，大部分被阻滞在G2期。裸鼠各治疗组与对照组比较，肿瘤生长减慢,肿瘤生长抑制率具有剂量时间依赖性,组织病理学检测显示治疗有效。结论：131I- Rituximab能够诱导Raji细胞凋亡并调控细胞周期，而且可特异性地定位于肿瘤组织,发挥放射免疫导向治疗作用,具有潜在的临床应用价值。

　　【关键词】 放射免疫治疗; B细胞淋巴瘤; 抗CD20单克隆抗体; 131I-Rituximab

　　非霍奇金淋巴瘤(NHL)是最常见的淋巴系统恶性肿瘤之一，其绝大多数是B细胞来源，放射免疫治疗(RIT)属于内照射治疗，已成为目前B细胞NHL治疗的研究热点。本实验将Rituximab-人鼠嵌合型抗CD20单克隆抗体偶联放射性核素131I，从体外和体内实验两方面研究其对B细胞淋巴瘤的生物学效应。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞与实验动物

　　人B淋巴瘤细胞系Raji细胞购于中国科学院上海细胞研究所;BALB/c裸鼠(4～6周龄)购于中国科学院上海实验动物中心，于东南大学医学院SPF动物房饲养。

　　1.2 主要试剂及器材

　　Rituximab购于罗氏制药公司，Na131I购于南京森科公司，Iodogen(四氯二苯基甘脲)由苏州大学医学院核医学实验室提供，流式细胞仪为FACS Vantage SE型，SPECT显像仪为德国西门子公司E.CAM9358型。

　　1.3 细胞培养

　　用含10%胎牛血清、100 U·ml-1青霉素、100 U·ml-1链霉素的RPMI 1640培养液，在37 ℃、5%CO2、95%湿度的培养箱中培养，2～3 d传代1次，取对数生长期细胞用流式细胞仪测定CD20表达率。

　　1.4 131I- Rituximab的制备

　　应用IODO- GEN法[1]标记，标记产物经Sephadex G- 25分离纯化，检测标记产物的标记率及放射化学纯度。

　　1.5 体外实验

　　1.5.1 分组 细胞换液后24 h，将细胞浓度调整为1×106 ml-1,分为4组。A组(131I- Rituximab组)：将131I- Rituximab加入Raji 细胞中，使131I- Rituximab的最终比放射性活度为3 μCi·ml-1(1 Ci=37 GBq)，Rituximab的最终浓度为50 μg·ml-1;B组(单纯核素组)：将Na131I加入Raji细胞中，使Na131I的最终比放射性活度为3 μCi·ml-1;C组(单纯抗体组)：将Rituximab加入Raji细胞中，使Rituximab的最终浓度为50 μg·ml-1;D组(空白对照组)：加入等量培养液。上述各组剂量参照文献[2]确定。

　　1.5.2 观察指标 加药24 h后显微镜下观察细胞形态，流式细胞仪测定细胞凋亡和细胞周期：以Annexin Ⅴ- FIFC/PI双染法测定药物对细胞的早期诱导凋亡作用，采用DNA倍体分析法检测细胞周期，重复测定3次。

　　1.6 体内实验

　　1.6.1 B细胞淋巴瘤动物模型的建立 将处于对数生长期的Raji细胞，用不含血清的RPMI 1640调整细胞密度为1×107 ml-1,每只裸鼠皮下接种0.2 ml,30 d后部分裸鼠成瘤，挑选肿瘤直径约为0.8 cm的30只成瘤裸鼠进行实验分组。

　　1.6.2 实验动物分组 成瘤裸鼠模型随机分为6组(每组5只)。a组(高剂量组)：尾静脉注射131I- Rituximab 400 μCi;b组(中剂量组)：尾静脉注射131I- Rituximab 150 μCi;c组(低剂量组)：尾静脉注射131I- Rituximab 50 μCi;d组(单纯抗体组)：尾静脉注射Rituximab 0.8 mg;e组(单纯核素组)：尾静脉注射Na131I 150 μCi;f组(空白对照组)：尾静脉注射生理盐水0.2 ml。上述各组剂量参照文献[3]确定。

　　1.6.3 治疗效果观察 (1)观察实验动物的一般状况包括精神状况、皮肤光泽、活动度、饮食、饮水情况，并称体重;(2)每隔3～4 d测量肿瘤的长径和短径，根据公式计算肿瘤体积和肿瘤生长抑制率(IR)：V=ab2/2(a为长径，b为短径)，IR=(V0-Vn)/V0×100%(V0代表非治疗组的肿瘤体积，Vn为治疗组的肿瘤体积);(3)SPECT显像：分别于注射后4、24、48、72、96、168 h显像;(4)组织病理学检测：治疗4周后处死裸鼠分离肿瘤,称重后用10%福尔马林固定,HE染色，作常规病理检查。

　　1.7 统计学处理

　　采用SPSS 13.0软件处理，进行方差分析，两两比较采用LSD法。

　　2 结 果

　　2.1 Raji细胞形态改变及CD20表达率

　　倒置显微镜下可见细胞为圆形，生长旺盛，聚集成团，透明度高，折光性强。流式细胞仪测定CD20表达率为98.03%。

　　2.2 131I- Rituximab的标记率及放化纯度

　　131I- Rituximab采用纸层析法测其标记率为90%，其稳定性好，4 ℃贮存24 h，其放化纯度为91%。

　　2.3 体外实验结果

　　2.3.1 镜下细胞形态学改变 A、B、C组细胞生长受到抑制，数量减少，细胞收缩，胞核变小。

　　2.3.2 细胞凋亡情况 细胞凋亡率 A组为59.94%，B、C、D组依次为48.21%、40.40%、1.06%，各组间差异具有统计学意义(P<0.05)。

　　2.3.3 细胞周期分析 (1)A组有17.13%的细胞截止于S期，B、C、D组依次有24.31%、25.73%、33.32%，除B组和C组之间差异没有统计学意义以外，余各组间差异有统计学意义(P<0.05)。(2)A组有69.01%的细胞截止于G2期，B、C、D组依次有65.10%、51.83%、50.13%。除A组和B组之间以及C组和D组之间差异没有统计学意义外，余各组间差异具有统计学意义(P<0.05)。

　　2.4 体内实验结果

　　2.4.1 实验动物的一般情况 b组裸鼠精神状况、活动度、皮肤状况、饮食饮水量及体重均未发现明显异常变化;a、c和d组裸鼠精神情况尚可，活动度较b组略差，饮食饮水量轻度减少;e组和f组在实验后期裸鼠精神萎靡，皮肤暗淡，体重减轻，饮食饮水量明显减少。a组分别在注射后第2、3天各有一裸鼠死亡，说明剂量过高，射线对裸鼠本身有一定伤害作用。

　　2.4.2 131I- Rituximab对肿瘤的抑制情况 如图1所示：a、b组随时间的延长肿瘤体积无明显增大甚至有所缩小，c、d组随时间的延长肿瘤体积稍增大，e、f组随时间的延长肿瘤体积有明显增大。各组裸鼠经治疗后第4周计算肿瘤生长抑制率，结果,a、b、c、d、e组依次为48.69%、47.60%、29.60%、17.27%、6.81%，各治疗组与对照组之间差异具有统计学意义(P<0.05)。6组裸鼠肿瘤的增生情况及治疗后第4周对肿瘤生长的IR计算结果表明，肿瘤生长IR与免疫药物之间具有剂量时间依赖性。

　　2.4.3 SPECT显像 给药后4、24、48、72、96及168 h利用SPECT显像。于注射后4 h肿瘤未见明显显影，周围组织及血本底较高;24、48 h后a、b、c组可见肿瘤部位放射性浓聚(图2)，e组未见明显肿瘤部位浓聚;72、96及168 h a、b、c 3组可见肿瘤图像逐渐变浅;24 h b组可见肿瘤部位放射性浓聚。

　　2.4.4 病理观察结果 e、f组肿瘤细胞增生活跃，可见较多的病理性核分裂相，偶见小灶性坏死;c、d组瘤细胞体积缩小，病理性核分裂相可见，肿瘤细胞核固缩、结构不清、破裂，肿瘤组织见小片坏死，部分区域肿瘤细胞全部坏死、消失;a、b组瘤细胞体积明显缩小，病理性核分裂相可见，肿瘤组织见大片坏死(图3)。

　　3 讨 论

　　放射免疫治疗(RIT)是近几年在分子靶向治疗基础上发展起来的新的治疗方法，即利用特异性抗体作载体，与能释放射线的放射性核素偶合，注入体内与肿瘤细胞特异性结合，实现对瘤体的内照射治疗，它不仅能杀伤与抗体结合的肿瘤细胞，还能杀伤邻近的不表达抗原及无法与抗体结合的细胞。

　　RIT淋巴瘤具有许多优势[4- 6]：(1)淋巴瘤细胞对射线具有高度敏感性;(2)RIT通过射线杀伤肿瘤，不必完全依赖补体依赖的细胞毒作用(CDC)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，因此即使机体免疫缺陷、抗原表达阴性或肿瘤免疫逃避等导致抗体及免疫毒素无效时，内照射仍可发挥作用;(3)标记抗体本身固有强大的抗肿瘤效应;(4)放射性核素释放的β射线能穿透多个细胞直径的距离，因此对于周围抗原表达阴性而没有结合核素的肿瘤细胞同样也有杀伤作用，这种作用称为“交叉火力作用”(cross fire);(5)与传统的分次、短时、高剂量外照射治疗相比，RIT为持续性低剂量内照射治疗,避免肿瘤细胞在放疗间隔期DNA的修复,且持续低剂量辐射使肿瘤细胞被阻止在对射线敏感的细胞周期G2期,从而增加放射性细胞毒作用。国外对该方面研究成果显著：90Y- ibritumomab和131I- tositumomab已被FDA批准用于难治、复发性NHL及CD20阳性的转型NHL的治疗[7]。

　　本实验从体外和体内实验两方面研究131I标记的Rituximab对B细胞淋巴瘤的生物学效应：体内实验观察131I- Rituximab对Raji细胞的早期凋亡及细胞周期的影响，体外实验观察131I- Rituximab对荷B细胞淋巴瘤裸鼠的治疗效果。选用IODO- GEN法把131I标记到Rituximab上标记方法简单，标记率及放化纯度均在90%以上，标记物稳定，证明IODO- GEN法有很强的实用性。Raji细胞的CD20表达率达98.03%，证明CD20是放免治疗B细胞淋巴瘤的良好靶点[8]，131I- Rituximab可与Raji细胞表面抗原CD20特异性结合，将131I固定到肿瘤细胞，131I所发射的β射线对肿瘤细胞产生辐射生物效应[9]，Rituximab在行使载体功能[8]的同时，其所产生的补体依赖的CDC和ADCC[10]共同作用抑制肿瘤生长。

　　体外实验中，由于131I- Rituximab中131I所发射的射线对细胞产生的辐射生物效应，使细胞内DNA断裂、交联，影响了DNA的复制和细胞的有丝分裂。本研究显示，131I- Rituximab作用于Raji细胞后其凋亡率为59.94%，而单纯抗体组仅为40.40%。131I- Rituximab组有17.13%截止于S期，单纯核素组、单纯抗体组、对照组依次为24.31%、25.73%、33.32%，提示治疗组肿瘤细胞增殖状态不佳;131I- Rituximab组有69.01%截止于G2期，单纯核素组、单纯抗体组、对照组依次为65.10%、51.83%、50.13%，提示射线将肿瘤细胞阻滞于G2期，阻止细胞进一步分裂。以上说明131I- Rituximab具有生物导向的治疗作用，通过持续低剂量辐射，使细胞被阻止在对射线最敏感的有丝分裂期，增强放射性细胞毒作用。

　　体内实验中，从6组裸鼠肿瘤的增生情况及治疗后第4周对肿瘤生长的IR来看，单独使用Rituximab已经有一定的抑瘤效果，其抑瘤率达到17.27%;使用低剂量131I- Rituximab的抑瘤效果要好于单独使用Rituximab的效果，这说明核素在其中起了增强作用;中剂量131I- Rituximab组的抑瘤效果最明显，甚至使肿瘤略缩小;高剂量131I- Rituximab组由于剂量太高，虽然也有明显的抑瘤效果，但是造成了正常组织的损伤，治疗效果不理想。

　　总之，131I- Rituximab在体内和体外均显示了较强的特异性杀肿瘤作用，适合以后作为免疫导向治疗的药物，针对B细胞淋巴瘤高表达的CD20抗原作为治疗靶点的免疫导向治疗前景乐观。肿瘤放射免疫治疗的发展为难治性复发性B细胞NHL治疗开辟了新的天地。通过131I- Rituximab对B细胞淋巴瘤生物学效应的实验研究，希望能够为其进一步临床应用提供实验依据。

　　【参考文献】

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