骨肉瘤基因治疗及载体系统研究现状

　　作者：宋亮，刘庆春，钟志凯，刘德传 作者单位：(解放军第175医院 肿瘤科，福建 漳州 363000)

　　【摘要】 近年来，有关骨肉瘤基因治疗的研究在基因治疗方法、基因载体、载体导入途径等方面取得了较大进展。骨肉瘤的基因治疗主要有免疫基因治疗、反义基因治疗、抑基因治疗、自杀基因治疗及联合基因治疗等。基因载体包括病毒载体和非病毒载体。

　　【关键词】 骨肿瘤;肉瘤;基因治疗;载体

　　骨肉瘤是一种临床常见恶性骨肿瘤，约占所有骨肿瘤的20%，其起源于间叶组织，以能够产生骨样组织的梭形基质细胞为特征，多见于青少年，好发于生长活跃的干骺端，恶性程度高，易复发和转移，预后较差。

　　目前骨肉瘤的治疗仍以手术治疗为主，放、化疗和生物治疗为辅的综合治疗为主要手段，5年生存率由上世纪70年代前的15%～20%提高到目前的80%左右。随着免疫学、分子生物学等相关学科的发展和完善，人们对骨肉瘤的发生机制在分子水平上有了更深的认识。骨肉瘤的发生是多基因、多步骤、多阶段、多重损伤并存的过程，骨肉瘤的基因表达不仅决定骨肉瘤的发生、发展和预后，而且也影响骨肉瘤治疗效果。目前骨肉瘤的基因治疗主要有免疫基因治疗、反义基因治疗、抑癌基因治疗、自杀基因治疗及其联合基因治疗等治疗方法。基因治疗机制主要是调节机体免疫系统或利用肿瘤细胞与正常细胞的差异对肿瘤细胞进行选择性攻击。

　　1 基因治疗方法研究

　　1.1 免疫基因治疗研究 在肿瘤发生发展过程中存在着机体免疫系统对肿瘤细胞的免疫耐受状态，而这种状态可能既源于肿瘤细胞本身的免疫源性不强(如MHC表达不足)，也可源于抗原呈递细胞不能提供足够的共刺激信号，或者机体免疫因子分泌不足及肿瘤细胞诱导机体免疫抑制等。因此一方面增强瘤细胞的免疫原性，就可对机体免疫系统产生较强的免疫刺激，激活体内CTL细胞产生特异性抗肿瘤作用，另一方面，也可以将一些与免疫识别有关的基因(如B7，MHC等)转移至体外培养的肿瘤细胞，然后再植入肿瘤患者，以增强肿瘤细胞对机体免疫系统的免疫原性，打破免疫耐受，以达到肿瘤基因治疗的目的。对骨肉瘤及其肺转移的基因治疗，研究较多的有B7分子系列和细胞因子，目前常用的细胞因子有IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18、M-CSF、GM-CSF和IFN-γ等，研究发现细胞因子能激活体内CTL细胞产生特异性抗肿瘤作用。

　　B7分子在T细胞活化中执行第2信号的功能，骨肉瘤细胞如不表达该分子或仅弱表达， 则无法被机体免疫系统识别监视而无限生长。将B7分子导入骨肉瘤细胞可以增强或诱发机体抗肿瘤免疫性并增强免疫细胞对骨肉瘤细胞的识别和杀伤能力。Jia等[1]利用PEI(聚乙二胺)作为IL-12基因载体(PEI：IL-12)导入有肺部微转移灶小鼠中，发现IL-12mRNA只在肺内表达而在肝中无表达，使用4周后小鼠肺内转移灶的体积明显变小和数量明显减少。

　　1.2 抑癌基因治疗研究 正常细胞由于抑癌基因突变缺失而易于发生突变，转化为肿瘤细胞。肿瘤抑制基因的失活与肿瘤的发生密切相关，将正常的肿瘤抑制基因导入肿瘤细胞可代替和补偿缺陷的基因以抑制肿瘤的生长或逆转其表型的这种替代疗法成为从根本上攻克肿瘤的关键环节。针对抑癌基因的基因治疗策略就是恢复因突变缺失而丧失的抑癌基因的正常功能。目前比较常见并已尝试用于基因治疗的肿瘤抑制基因有p53、p16、Rb、p21、p27等。p53抑癌基因是目前研究较为深入的抑癌基因之一，它的缺失或失活与人类50%以上肿瘤的发生发展密切相关。p53的功能增强，可使细胞周期阻滞，细胞分化或凋亡。从而减少了含错误遗传信息的细胞复制增殖与引起细胞恶变的机会。凋亡相关基因bcl-2、p15、p16及Rb基因均与骨肉瘤的生长增殖相关，它们的缺失在骨肉瘤中广泛存在，因此，在基因研究中亦被广泛应用。

　　1.3 反义基因治疗研究 反义基因治疗基本原理是根据靶基因结构特点设计反义寡核苷酸(AS-ODN)分子，导入靶细胞或机体后与双链DNA结合形成三聚体(triplex)或与mRNA结合形成DNA-RNA和RNA-RNA杂合体，从而封闭或抑制特定基因的复制或表达，以减少其“下游”产物蛋白或酶的表达水平。反义基因治疗通过反义核酸技术实现，反义核酸是按照碱基互补配对原则，能够与互补链(靶基因或其表达的mRNA)特异结合，从而影响靶基因转录或翻译的RNA或DNA片段;另一种方法是利用特定的AS-ODN在细胞质中与特定蛋白质的mRNA进行杂交，结果正常mRNA的翻译被抑制、降解，正常的蛋白质不能表达;还有报道AS-ODN与mRNA结合后，能够激活RNA酶H使mRNA水解，拷贝数降低，而AS-ODN释出仍能继续结合mRNA，使之进一步减少。骨肉瘤中常见有许多癌基因(如mdm2、C-myc等)及抑癌基因(如p53、Rb等)的异常表达。

　　p53是一种重要的抑癌基因，应用反义技术针对突变p53基因或其mRNA设计出反义核酸片断，封闭突变p53基因，抑制其表达，进而导入wt-p53，这对有获得性功能的p53突变骨肉瘤的基因治疗有重要意义。Tsang等[2]将MRP1和p53AS-ODN转染入p53高突变的SAOS细胞中，发现细胞呈现对阿霉素的敏感性，而且加入p53AS-ODN后明显抑制MRP1的表达并逆转了细胞对阿霉素的耐药性。骨肉瘤中常有mdm2的过表达，通过反义技术抑制或封闭mdm2基因的表达，解除对p53诱导凋亡功能的抑制，能有效提高抗肿瘤药物诱导肿瘤细胞凋亡的效应。

　　C-myc原癌基因的过表达与骨肉瘤细胞的生长、增殖、转移及病人预后有密切关系。应用反义核酸技术将C-myc AS-ODN转染入骨肉瘤细胞中能够抑制C-myc基因的表达，影响细胞增殖周期，诱导肿瘤细胞的凋亡，从而抑制肿瘤细胞的生长，以达到基因治疗的目的。Xie等[3]构建表达反义C-myc的重组腺病毒(Ad-As-C-myc)，并在体外转染骨肉瘤MG-63，U20s细胞，发现Ad-As-C-myc能够产生G2/M期或G1期阻滞，诱导骨肉瘤细胞凋亡，并抑制骨肉瘤细胞的增殖。

　　1.4 自杀基因治疗研究 肿瘤自杀基因疗法又称为病毒导向酶解药物前体疗法。其原理是将一些病毒或细菌基因组中的前药转换酶基因，即自杀基因构建表达在载体上，导入肿瘤细胞，这种基因可以编码特殊的酶，将原先无毒性的前药在肿瘤细胞中代谢为毒性产物，通过干扰细胞分裂时DNA合成，从而达到杀死肿瘤细胞的目的。此外，某些自杀基因介导的肿瘤基因治疗还具有“旁观者效应”，增强了细胞毒效应。

　　目前已发现和克隆的自杀基因有多种，包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶(VzV-TK)基因、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(EC-CD)基因、大肠杆菌脱氧胸苷激酶(DCK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(GGT)基因及细胞色素p450基因。目前针对骨肉瘤的自杀基因研究主要有HSV-Tk(单纯疱疹病毒-胸腺嘧啶激酶)、CD/5Fc(胞嘧啶脱氨酶)等。Seto等[4]将HSV-1-Tk基因在体外转染入骨肉瘤细胞株LM8后，发现骨肉瘤细胞对GCV异常敏感，很容易被杀死。在体内实验中也观察到明显的肿瘤生长及肺转移的抑制作用。Graat等[5]将腺病毒Ad5-Δ24RGD通过静脉注入人体5～7周后发现，骨肉瘤肺部转移瘤的体积和重量显著性减少。

　　1.5 联合基因研究 联合基因研究及基因联合其他疗法治疗骨肉瘤的疗效可能更好，联合应用可能产生协同效应，减少耐药性，增加敏感性而增加疗效，并可能较单用一种药的毒副作用小，具有更加广阔的应用前景。

　　目前研究最多的是自杀基因与细胞因子的基因联合治疗。Tsuji等[6]则用腺病毒介导B7-1/Fas基因转染鼠骨肉瘤细胞，发现能同时激活T细胞的免疫效应，并能诱导肿瘤细胞的凋亡，在抑制骨肉瘤肺转移和提高生存率方面较单一的B7-1基因更为有效。已有将B7基因分别和GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18等基因联合应用的报道，均诱发了较强的抗肿瘤作用和免疫应答作用，并强于单独基因免疫效应。CD/5Fc(胞嘧啶脱氨酶)及Dm-dNK(黑腹果蝇DNA激酶)等自杀基因在骨肉瘤的联合治疗中也得以应用。将MRP1和p53AS-ODN转染入p53高突变的SAOS细胞中，并联合应用阿霉素，加入p53AS-ODN后可明显抑制MRP1的表达并逆转细胞对阿霉素的耐药性。

　　2 基因载体研究

　　无论是哪种基因疗法，均需构建能将外源基因特异性转移至靶细胞的载体，因此载体的安全、无毒与否就成为基因治疗能否成功的关键环节。骨肉瘤基因治疗的载体主要有病毒载体和非病毒载体。病毒载体转染率高，但受免疫原性、细胞毒性大、携带外源基因大小受限和病毒滴度不易提高等限制。非病毒载体虽然转染率较低，但安全、制备简单，且可携带较大容量的外源性基因，新兴的纳米载体为一种新的非生物材料，因无免疫原性、无遗传毒性和具有较高的转移率等优势而越来越引起重视。

　　2.1 非病毒载体 非病毒载体是运用理化方法介导基因转移的工具，近年来发展迅速。除具备无传染性，不限制载体容量，化学结构可控制及易于大量制备等优点外，与病毒载体相比还具有低毒、低免疫反应，所携带的目的基因不整合至宿主细胞基因组等优势，

　　转运DNA的非病毒载体主要有非生物性聚合物载体转运系统和脂质体转运系统(DNA包裹于或混合于脂质体中)两类[7]。阳离子聚合物载体可与DNA结合形成复合物。其携带片段较大，同时可对其进行修饰，应用前景广阔。聚乙烯亚胺(polyethyleni-mine，PEI)具有很高的转染率。小分子量的PEI转染率高且毒性小，而大分子PEI转染率高但在体内滞留时间长，毒性大。因此，寻找大小合适的分子以使其转染效率最高而毒性最小，是PEI研究的重要方向。Jia等[1]利用PEI介导IL-12基因并通过鼻饲的方法治疗骨肉瘤的肺转移，实验表明PEI是骨肉瘤肺转移基因治疗中传递基因的良好工具。利用PEI-p53复合体气溶胶方法治疗人骨肉瘤小鼠肺转移模型，可有效地减少肺转移灶数目和大小，同时可减少全身毒性。

　　脂质体无毒性和免疫原性，也是基因治疗常用的非病毒载体，它可通过被宿主细胞融合、内吞等方式将其携带的核酸分子送入细胞。它包括带正电荷的或阳离子型脂质体和带负电荷的或pH敏感的脂质体两种类型，前者更为常用。Okumura等[8]应用阳离子脂质体转移Bax基因至已移植有人骨肉瘤细胞的裸鼠体内，发现阳离子脂质体转移基因能明显诱导体内人骨肉瘤细胞凋亡。Nakase等[9]利用经转铁蛋白修饰的阳离子脂质体转运p53基因并导入预先移植有人骨肉瘤细胞的裸鼠体内，发现肿瘤停止生长且体积明显缩小至对照组的10%左右，同时Bax基因转录活性与p53依赖的凋亡途径直接相关，即基因激活也依赖于野生型基因活性;预测该方法将在骨肉瘤基因治疗中起重要作用。肖华斌等[10]在将Rb反义寡核苷酸(AS-ODN)转染人成骨肉瘤(MG-63)细胞的研究中，发现使用脂质体后反义寡核苷酸的转染率明显增高。

　　2.2 病毒载体 病毒载体具有低毒、高效、大容量，可控基因转导及表达等一系列特点，目前已被广泛用于基因治疗研究和临床试验，约占70% 。目前最常用的主要是逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)、腺病毒载体和腺相关病毒载体等。

　　逆转录病毒载体即是将结构基因去除换成外源性基因，在体外包装细胞内组装成含有目的基因的重组逆转录病毒，不具有致病性。逆转录病毒感染细胞后整合至细胞染色体上，从而实现携带外源性基因的作用。逆转录病毒载体的特点为：(1)能有效整合至宿主基因组中，使其携带的外源性基因可持续稳定表达;(2)感染谱广泛，引起的机体免疫反应较低;(3)只感染分裂细胞，使骨肉瘤细胞成为天然的靶细胞，但也有一些瘤细胞总处于静止期而逃避基因治疗;(4)逆转录病毒DNA复制中间体在整合入细胞染色体时为随机整合，因此外源性基因也会随机插入细胞染色体中，其表达会受插入位点两侧DNA序列影响，并有可能导致插入突变;(5)携带外源性基因的容量大(最大可10kh);(6)转染率高，靶向性差，体内病毒滴度较低。

　　腺病毒作为一种基因转移载体，具有宿主范围广、转染率高、插入外源性基因容量大、病毒滴度高、不与宿主染色体整合等优点，已广泛应用于肿瘤基因治疗研究[11]。Ganjavi等[12]利用腺病毒作为载体将p53基因导入4种骨肉瘤细胞系(Saos-2、HOS、KHOS/NP、MNNG)治疗骨肉瘤，72 h 后发现导入含野生型p53基因腺病毒的骨肉瘤细胞活性呈剂量依赖性下降，同时这种转导大大提高了骨肉瘤细胞对顺铂和阿霉素的敏感性。另外，使用腺病毒为载体将反义c-myc片断转染入人骨肉瘤细胞中，可取得满意效果。近来对腺病毒载体进行了改造和修饰，增强其感染或表达的靶向性，并已应用于恶性肿瘤靶向治疗。利用重组腺病毒-骨钙素启动子-自杀基因(Ad_OC-TK)体内转染鼠骨肉瘤细胞，可高选择性地阻断肿瘤细胞生长，与化疗相结合可显著提高荷瘤小鼠的存活率。

　　腺相关病毒载体(AAV)是最常用的基因转运系统之一，该病毒属微小病毒科的一类小DNA病毒。Seth[13]证实，腺相关病毒载体在大多数组织的不同类型细胞中均可高效表达转基因DNA，其缺点主要是包装能力有限、不能大规模生产。此外，这类病毒在复制过程中需要腺病毒和单纯疱疹病毒辅助，易造成污染。人腺相关病毒载体的预存免疫力可与腺病毒相媲美。这类病毒目前已在肿瘤基因治疗中得到应用，并有逐步取代腺病毒之势。

　　3 存在的问题及展望

　　肿瘤基因治疗是医学史上的一场革命，基因治疗为肿瘤的生物学治疗提供了一种崭新的治疗手段，为彻底攻克癌症寄予了很高的期望，其疗效已在体内外实验中得到了充分的证实，部分临床试验已取得了显著的疗效，但不可否认癌症基因治疗的临床治疗效果远非像人们期待的那样令人满意。目前存在的问题主要是因为癌症的基因治疗存在着有效性和安全性等问题，主要表现在以下几个方面：(1)目前的载体系统不能特异性地靶向肿瘤细胞，如静脉注射，载体可与正常组织细胞非特异性的结合而被清除，从而降低了疗效;(2)治疗基因在肿瘤细胞内不能高效、稳定、持续地表达;(3)单基因治疗效果差;(4)高滴度的病毒载体在体内往往会引起机体的免疫反应;(5)如果选用逆转录病毒载体，治疗基因往往会随机插入到染色体上，可能会引起插入突变或细胞的恶性转化等。相信随着科研人员对癌症发病分子机制研究的不断深入、基因转移技术的革新，以及对体内重组载体表达调控技术的提高，骨肉瘤的基因治疗必将具有广阔的发展前景。

　　【参考文献】

　　[ 1] Jia SF, Worth LL, Densmore CL,et al.Aerosol gene therapy with PEI: IL-12 eradicates osteosarcoma lung metastases[J].Clin Cancer Res,2003,15;9(9):3462-3468.

　　[ 2] Tsang WP， ChauSP， Fung KP， et al. Modulation of multidrug resistance-associated protein 1(MRP1)by p53 mutant in Saos-2 cells[J].Cancer Chemother Pharmacol，2003，51(2)：161.

　　[ 3] Xie XK，Yang DS，Ye ZM ，et al.Construction of antisense C-myc recombinant adenovirus and its anti-tumor effects on osteosareoma cell lines MG-63 and U20S[J].Cancer,2005，24 (3)：292.

　　[ 4] Seto M,Yamazaki T,Sonoda J,et al.Suppression of tumor growth and pulmonary metastasis in murine osteosarcoma using gene therapy[J].Oncol Rep，2002，9(2)：337.

　　[ 5] Graat HCA, Van Beusechem VW, Schagen FHE，et al. Intravenous administration of the conditionally replicative adenovirus Ad5-Δ24RGD induces regression of osteosarcoma lung metastases[J].Mol Cancer,2008,23:7-9.

　　[ 6] Tsuji H, Kawaguchi S, Wada T,et al.Concurrent induction of T-cell activation and apoptosis of osteosarcoma cells by adenovirus-mediated B7-1/Fas chimeric gene transfer[J]. Cancer Gene Ther,2003,10(9):717-725.

　　[ 7] Patil SD，Rhodes DG，Burgess DJ.DNA-based therapeutics and DNA delivery systems：a comprehensive review[J].AAPS J，2005,7(1)：E61-E77.

　　[ 8] Okumura K，Nakase M，Nakamura S，et al.Bax gene therapy for osteosarcoma using cationic 1iposomes in vivo[J].Oncel Rep，2007,17(4)：769-773.

　　[ 9] Nakase M，Inui M，Okumura K，et al.P53 gene therapy of human osteosarcoma using a transferrin-modified cationic liposome[J].Mol Cancer Ther，2005,4(4)：625-631.

　　[10] 肖华斌，包 杰，周江南.Rb反义寡核苷酸对人骨肉瘤细胞凋亡及化疗药敏的影响[J].南华大学学报(医学版)，2004,32(1)：54-57.

　　[11] Kanerva A，Hemminki A.Adenoviruses for treatment of cancer[J].Ann Med，2005,37(1):33-43.

　　[12] Ganjavi H, Gee M, Narendran A,et al.Adenovirus-mediated p53 gene therapy in osteosarcoma cell lines: sensitization to cisplatin and doxorubicin[J].Cancer Gene Ther,2006，13(4):415-419.

　　[13] Seth P.Vector-mediated cancer gene therapy:all oxrerview[J].Cancer Biol Ther,2005,4(5):512-517.