乳腺癌中CXCR4的表达及与PCNA、淋巴结转移的关系

　　作者：李文仿, 谭最, 王耕, 王明华, 惠震 作者单位：1 郧阳医学院附属太和医院,湖北 十堰 442000;2 武汉大学医学院附属中南医院，湖北 武汉 430071

　　【摘要】目的：探讨趋化因子受体CXCR4在乳腺癌中的表达及与PCNA、淋巴结转移的关系。方法：S-P法检测乳腺癌、乳腺增生组织及乳腺纤维腺瘤中CXCR4表达，分析CXCR4在乳腺癌中的表达与患者淋巴结转移状态、PCNA相互关系。结果:CXCR4在乳腺癌组织中表达率为59.4%(38/64)，与乳腺纤维腺瘤组织有显著性差异(P< 0.05)，与患者淋巴结转移状态、PCNA正相关(P<0.05)。结论：乳腺癌中CXCR4高表达，更易发生淋巴结转移及较高PCNA表达，有望成为新的乳腺癌治疗靶点。

　　【关键词】 乳腺癌;CXCR4;增殖细胞核抗原;淋巴结转移

　　Expression of CXC Chemokine Receptor-4 in Breast Cancer and its Correcation with the State of Lymphatic Metastasis and the Expression of Proliferating Cell Nuclear Antigen

　　LI Wen-fang1, TAN Zui2, WANG Geng1*,WANG Ming-hua1, HUI Zhen1

　　(1Department of Endocrine and Vascular Surgery, Taihe Hospital, Yunyang Medical College, Shiyan, Hubei 442000; 2Zhongnan Hospital, Wuhan University, Wuhan, Hubei 430071, China)

　　Abstract: Objective To investigate the expression of CXC chemokine receptor 4 in breast cancer and its correlation with the state of lymphatic metastasis and the expression of proliferating cell nuclear antigen(PCNA). Methods S-P immunohistochemical technique was used to estimate the expression of chemokine receptor in breast cancer and hyperplasia of mammary glands , fibroadenoma of breast. CXCR4 expression in breast cancer was correlated with the expression of PCNA and the state of lymphatic metastasis. Results The rate of expression of CXCR4 in breast cancer was 59.4%, which had significant difference with fibroadenoma of breast(P<0.05), and had positive correlation with the state of lymphatic metastasis and the expression of PCNA(P<0.05). Conclusion Expression of CXCR4 in breast cancer has more possibilities of lymphatic metastasis and high expression of PCNA, which may become a new therapeutic target in the treatment of breast cancer.

　　Key words：Breast cancer; CXC chemokine receptor 4; Proliferating cell nuclear Antigen; lymphatic metastasis

　　趋化因子(chemokines)是分子量为8～12 kDa的分泌型小分子多肽细胞因子，趋化因子CXCL12即基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)，与其受体CXCR4在介导恶性肿瘤的发生、侵袭、转移中有重要作用[1-2]。乳腺癌是女性乳腺常见的癌肿之一，乳腺癌的发生和发展伴随着明显的分子生物学改变。乳腺癌肿瘤细胞增殖及淋巴结转移状态可反映乳腺癌细胞的生物学活性，对预测预后有较大的帮助[3]。本研究通过免疫组织化学方法，探讨CXCR4与乳腺癌细胞增殖及淋巴结转移的相互关系，判断其在乳腺癌中表达的临床价值。

　　1 材料与方法

　　1.1 一般资料

　　收集本院1998年-2006年间乳腺癌患者切除术后石蜡标本64例，均为女性，年龄29~66岁，中位年龄43岁。患者均经病理检查为浸润性乳腺导管癌，有淋巴结转移39例，无淋巴结转移25例。同时收集我院住院患者乳腺增生组织及乳腺纤维腺瘤组织各20例，每例标本均经10%福尔马林浸泡固定、石蜡包埋、4 μm切片，烤片后脱腊至水。

　　1.2 免疫组织化学染色

　　兔抗人CXCR4单克隆抗体，鼠抗人PCNA单克隆抗体(武汉博士德生物公司)，免疫组化试剂盒和DAB显色液(福建迈新公司)。切片脱蜡、微波抗原修复，过氧化酶阻断内源性酶活性，动物血清37 ℃孵育。加一抗(兔抗人CXCR4、鼠抗人PCNA单克隆抗体)，4 ℃过夜;再加生物素标记的二抗，37 ℃孵育15 min;加入链霉素-抗生素-过氧化物酶溶液，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封固。以博士德公司提供阳性片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。

　　1.3 阳性细胞计数和结果判断

　　趋化因子受体CXCR4的阳性判断：每张切片由两名病理医生在10×40高倍视野双盲随机观察100个肿瘤细胞，每个视野计算100个肿瘤细胞中的阳性细胞数，取其均值作为CXCR4阳性表达率。按阳性细胞率和肿瘤细胞着色强度进行评分，按阳性细胞百分率：0分为<5%，1分为5%～10%，2分为10%～20%，3分为20%～50%，4分为>50%;按着色强度计分：0分为无着色，1分为淡黄色，2分为黄色，3分为棕黄色。两者乘积≤2分判断为阴性病例，>2分判断为阳性病例。

　　PCNA染色结果标准：整张切片未见阳性染色细胞为0级(-);癌细胞核着色细胞25%以下，为1级(+);25%～50%为2级(++);50%以上3级(+++)。

　　1.4 数据分析

　　SPSS11.0统计分析软件进行χ2检验，P<0.05被认为差异有显著性，值取双侧。

　　2 结果

　　2.1 CXCR4在乳腺癌、乳腺增生组织及乳腺纤维腺瘤组织中的表达情况

　　胞浆染色根据染色强度不同，显色从无色、淡黄至棕黄色不等，呈局灶或弥漫性分布(见图1~3)。乳腺癌组织与乳腺纤维腺瘤组织CXCR4表达有明显差异(P=0.007)，乳腺癌中CXCR4与乳腺增生组织无明显差异(P=0.056)，但阳性表达率较乳腺增生组织高(见表1)。

　　2.2 CXCR4在乳腺癌中的表达与乳腺癌患者 PCNA淋巴结转移的关系

　　乳腺癌细胞PCNA胞核呈阳性表达(见图4)。淋巴结未转移组与淋巴结1~3枚转移及4枚以上淋巴结转移组间比较，差异有显著性(P<0.05)。Spearman相关分析r=0.316 (P=0.011)。CXCR4在乳腺癌中的表达与乳腺癌PCNA关系：免疫组化染色PCNA胞浆0~1级表达乳腺癌标本23例，CXCR4阳性表达9例(39.1%)，2~3级PCNA表达乳腺癌标本41例，CXCR4阳性表达29例(70.7%)，两者差异有显著性(P<0.05)(见表2)。

　　趋化因子CXCL12即基质细胞衍生因子1(SDF-1)，与其受体CXCR4在介导恶性肿瘤的浸润转移中发挥重要作用。趋化因子与其受体结合，通过偶联不同的信号传导途径，具有介导肿瘤细胞迁移、生长、转录、活化等多种不同的生理功能。最近研究表明CXCL12/CXCR4构成的生物学轴可能在乳腺癌细胞获得侵袭和转移特征中有重要作用。

　　乳腺癌与其它肿瘤一样，由一系列分子学改变引起正常细胞向癌细胞转变并具备侵袭和转移潜能。Porter[4]等研究发现，在乳腺癌发生过程中伴随着明显的趋化因子受体改变，在正常乳腺组织中CXCR1、CXCR2、CXCR6、CXCR8等趋化因子受体高表达，在乳腺癌进展中丢失，但CCR4、CX3C11、CXCR5、CCR5等趋化因子受体在Ⅱ、Ⅲ级乳腺癌中仍表达，同时检测到CXCR4 mRNA在乳腺癌中高表达。Schmid[5]等采用组织芯片(Tissue Microarrays，TMA)技术结合免疫组化方式检测比较CXCR4在乳腺癌、乳腺增生组织、正常乳腺组织中的表达情况，发现在乳腺癌组织中CXCR4高表达，而在乳腺增生组织及正常乳腺组织中检出率低。

　　本研究表明CXCR4随乳腺病变恶性程度逐步升高，乳腺癌中CXCR4表达率为59.4%，与纤维腺瘤组织有显著性差异(P<0.01)，与乳腺增生组织间CXCR4无显著性差异(P>0.05)，但较乳腺增生组织中阳性表达率(35.0%)高。重度乳腺不典型增生是乳腺癌前危险因素，本组与乳腺增生组织间CXCR4表达差异无显著性，可能与标本选择均为乳腺增生较重的乳腺组织及标本量较少等有关。另外，李红霞[6]等研究也表明CXCR4蛋白在乳腺癌中高表达，而在乳腺良性增生及正常乳腺组织中表达微弱，表明乳腺癌中CXCR4过表达在其发生发展过程中可能有重要生物学意义。

　　乳腺癌有着显著的转移特征，可早期发生淋巴结、肝脏、肺等脏器转移。1989年Paget[7]首次提出“种子和土壤”理论，认为肿瘤细胞特异性脏器转移源于不同脏器为肿瘤细胞提供不同特异性生长条件，但具体机制并不清楚。随后众多学者研究发现趋化因子及其受体与多种肿瘤生长和转移直接相关，尤其CXCL12/CXCR4可能在黑素瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤等恶性肿瘤的特异性转移中具有重要的作用。Muller等[8]报道人乳腺癌细胞系高表达CXCR4，而在乳腺癌最常见的转移部位如淋巴结、肺、肝脏等处高水平表达其配体SDF-1，认为体内靶器官高度一致性表达其配体SDF-1是引起乳腺癌细胞靶向转移的重要原因。Cabioglu[9]等发现CXCR4和HER2或EGFR共表达更易在骨髓中检测到细胞角蛋白(CK)阳性ITCs(独立癌细胞)，提示乳腺癌细胞可能通过CXCL 12/CXCR4生物轴更易早期发生骨髓微转移，认为CXCR4可能成为早期诊断骨髓微转移(BM)的有效生物学指标。

　　本组研究显示乳腺癌组织CXCR4的阳性表达与淋巴结转移多少(P <0.05) 相关，表明CXCR4在促进乳腺癌细胞的淋巴结转移过程中起重要的作用，阻断CXCR4表达可能有效抑制乳腺癌细胞转移。其它学者进行的研究也多支持乳腺癌细胞通过CXCL12/CXCR4生物学轴转移的理论。Andre等[10]研究表明CXCR4阳性表达乳腺癌细胞更易发生肝转移。Kato等[11]对79例浸润性导管癌切除的组织研究也表明几乎所有的组织都表达CXCR4，而高表达尤其是局灶性高表达者伴有广泛的淋巴转移。Muller及其同事开创性工作揭开了趋化因子与乳腺癌转移关系史上新的一页,为阐明乳腺癌转移机制提供了极其重要的线索。

　　恶性肿瘤细胞具有异常增殖能力，肿瘤细胞的增殖能力与肿瘤患者的生存密切相关，而肿瘤细胞获得增殖的过程中伴随着众多分子生物学指标的变化，使肿瘤细胞获得更强的侵袭及转移能力。

　　PCNA即核增殖抗原，是一种与细胞增殖相关的抗原，又称周期素。它在细胞增殖周期G1晚期开始增加，S期达到高峰，G2、M期开始明显下降，能很好地反应细胞增殖周期的状况，客观评估肿瘤细胞增殖和生长速度，是较好评价细胞增殖恶性程度指标之一。本研究以PCNA阳性表达显示乳腺癌细胞增殖活性，探讨CXCR4与乳腺癌细胞增殖的关系。研究表明乳腺癌细胞CXCR4表达与胞内PCNA明显相关(P<0.05)，表明CXCR4在乳腺癌中过表达可能促进乳腺癌细胞增殖，与乳腺癌细胞不断生长并转移有关。国外也有相关文献报告CXCR4与乳腺癌细胞的生长相关。Lapteva[12]报告干扰RNA诱导的CXCR4下调可消除乳癌细胞的原位生长，而Smith等[13]发现乳腺癌中CXCR4的表达不仅可明显促进原发灶的生长，而且可促进转移灶的生长，抑制CXCR4既减少原发肿瘤也减少转移癌的增生，提示CXCR4在乳腺癌细胞增殖中可作为一个潜在的治疗靶点。

　　CXCR12/CXCR4在促进乳腺癌生长及增加转移能力中的重要作用，使控制乳腺癌趋化网落可能在乳腺癌中有潜在的治疗价值，为临床寻找抗转移新药提供了重要的依据。

　　(文中图1~4见封二)

　　【参考文献】

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　　[11]Kato M, Kitayama J, Kazama S, et al. Expression pattern of CXCR4 is correlated with lymph node metastasis in human invasive ductal carcinoma[J].Breast Cancer Res,2003,5(5):144 -150.

　　[12]Lapteva N, Yang AG, Sanders DE. CXCR4 knock down by sm- all interfering RNA abrogates breast tumor growth in vivo[J].Cancer Gene Ther, 2005, 12(1): 84-89.

　　[13]Smith MC, Luker KE, Garbow JR, et al. CXCR4 regulates growth of both primary and metastatic breast cancer[J]. Cancer Res, 2004, 64(23): 8 604-8 612.