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《肿瘤学》

癌基因C-K-ras和抑癌基因Rb突变与胰腺癌发生的关系

发表时间:2010-09-03  浏览次数:433次

  作者:关泽红 刘旭东 刘淑萍 云志厚 孟化 张建宇 姜彩虹 作者单位:内蒙古医学院生物化学与分子生物学教研室,内蒙古呼和浩特 010059

  【摘要】目的:探讨癌基因C-K-ras和抑癌基因Rb点突变与胰腺癌发生的关系。方法:选择经病理学证实的原发性胰腺癌19例、胰腺癌恶性淋巴瘤1例、胰腺多形细胞癌2例和慢性胰腺炎5例的石蜡包埋组织样本,采用PCR-SSP法检测C-K-ras 12位密码子和Rb第21位外显子的点突变情况。结果:19例原发性胰腺癌石蜡包埋块样本中有7例C-K-ras 12密码子发生了点突变,占36.8%,其中1例为两种突变形式(GAT、GTT);有9例Rb第21位外显子发生了点突变,占47.3%;而在胰腺癌恶性淋巴瘤、胰腺多形细胞癌和慢性胰腺炎样本中均未检出上述突变情况。结论:C-K-ras 12位密码子和Rb第21外显子点突变与胰腺癌的发生有一定的相关性。

  【关键词】 胰腺癌;癌基因C-K-ras;抑癌基因Rb;点突变

  Correspondence of Mutation of Oncogene C-K-ras and Antioncogene Rb with the Occurrence of Pancreatic

  Carcinomas

  GUAN Zehong, LIU Xudong, LIU Shuping, et al

  Department of Biochemistry and Molecular Biology, Inner Mongolia Medical College, Huhehot 010059, China

  Abstract Objectives: To study the correspondence of point mutation of oncogene C-K-ras and antioncogene Rbwith the occurrence of pancreatic carcinomas. Methods: The point mutation of C-K-ras at 12 codon and Rb at 21thexon were detected by PCR-SSP in the araffin embedding samples of 19 cases of pancreatic carcinomas ,1 case ofpancreatic lymphoma , 2 cases of pancreatic polymorphous cell carcinomas and 5 cases of cronic pancreatitis.Results: C-K-ras mutation at 12 codon were detected in 7 cases of the 19 pancreatic carcinoma samples (37%), oneof which displayed two kinds of mutation (GAT and GTT); Of 19 cases of pancreatic carcinomas,9 cases were detectedwith mutation of Rb 21th exon (47.4%); No mutation in C-K-ras 12th codon and Rb 12 exon were detected in cronicpancreatitis,pancreatic lymphoma and pancreatic polymorphous cell carcinomas samples. Conclusion: There is somecorrespondence of point mutation of oncogene C-K-ras and antioncogene Rb with the occurrence of pancreaticcarcinomas.

  Key words Pancreatic carcinomas;Antioncogene; Rb; Oncogene; C-K-ras ; Point mutation

  胰腺癌(Pancreatic Carcinoma)是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一。它的发病率在西方国家的过去30年间增加了3倍[1],中国增长了6倍[2]。由于其发病隐匿,尚缺早期诊断手段,一经确诊常常已到晚期,错过了最佳治疗时期,致使预后极差,五年生存率不足2%。随着分子医学与分子生物学的发展及许多新技术新方法的应用,逐步揭示了许多疾病的发生与基因突变或表达异常有关。目前比较一致的看法认为,肿瘤的发生是由于细胞生长调控机制紊乱造成的。正常细胞的增殖分化是由两大类基因调控的,一类是正调控信号,促进细胞的生长和增殖,并且阻止其向终末分化,现知多数癌基因起这一作用;另一类是负调控信号,促进细胞成熟,向终末分化,最后凋亡,现知抑制癌基因可能发挥这方面的作用。正常情况下,这两种信号保持动态平衡,对细胞生长、增殖和凋亡进行精确的调控。一旦两者之间平衡被破坏,如癌基因激活或抑癌基因失活,必将导致细胞增殖紊乱而发生癌变。近年来的研究表明,癌基因或抑癌基因突变是细胞癌变的关键性因素,可望成为癌症早期诊断的重要指标。本文通过检测胰腺癌组织中癌基因C-K-ras和抑癌基因Rb的点突变情况,研究胰腺癌发生的分子机理,分析癌基因C-K-ras和抑癌基因Rb的点突变作为胰腺癌早期诊断的可能性。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  45例标本来自呼和浩特地区内蒙古医学院和内蒙古医院病理科,所有标本均经10%福尔马林固定、石蜡包埋,病理组织学证实为胰腺癌,其中胰腺癌37例,胰腺恶性淋巴瘤1例,胰腺多形细胞癌2例,慢性胰腺炎5例。

  1.2 主要仪器试剂

  台式高速离心机,TGL,上海制造;水平式电泳槽,DYY-Ⅲ31B,北京制造;微电脑DNA扩增仪,1109型,北京制造;PCR试剂盒和标准DNA Marker,华美生物工程公司北京分公司;Rb基因PCR引物由上海生物工程有限公司合成;C-K-ras基因PCR引物由华美生物工程公司北京分公司合成;其它试剂均为分析纯,国内生产。

  1.3 方法

  石蜡包埋组织中DNA模板的提取[3]:每份标本切5μm厚切片,苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色后经光学显微镜下鉴定组织。另连续切4片,置2mL无菌Eppendorf试管分装。脱蜡:每管加二甲苯1 000μL,溶解30min,14 000rpm离心5min,弃上清;沉淀中加二甲苯1 000μL,溶解30min,离心5min,弃上清;加无水乙醇1 000μL,翻转混匀2min,离心5min,弃上清;加无水乙醇1000μL,再翻转混匀2min,离心5min,弃上清;加75%乙醇1 000μL,翻转混匀2min,离心5min,弃上清;加丙酮500μL,翻转混匀2min,离心5min,弃上清;置55℃水浴干燥5min。消化:每管加Lysis BufferⅡ(含蛋白K)200μL,置55℃水浴2h,95℃水浴灭活蛋白酶10min,置-20℃保存做PCR模板。

  PCR扩增[4]:30μL反应体系中含20×buffer 1.5μL,1.7mmol/L MgCl 1.8μL,各200μmol/L的四种dNTP .3μL,0.5mmol/L的引物各0.2μL,模板4μL,Taq DNA聚合酶1.5~2U,双蒸水补到30μL。反应步骤:94℃预变性300s,然后进入循环,94℃变性45s,55℃退火45s,75℃延伸45s,共进行35个循环。最后72℃延伸300s。

  PCR产物的鉴定:在30μL扩增产物中加入0.25%溴酚兰和0.25二甲苯菁一滴,在含有10mg/mL溴化乙碇的3%琼脂糖凝胶上电泳,电泳缓冲液为1×TBE,电压100V,电流10mA/cm2,时间30~40min。电泳结束后紫外灯下观察结果。

  2 结果

  37例胰腺癌中有19例提取到完整DNA,占51.3%(19/37)。其余由于标本存放时间长和DNA提取时造成基因断裂。在提出的19份DNA中,C-K-ras基因12位密码子突变的7例,占36.8%(7/19),总突变方式8,其中两种突变的1例(GAT,GTT)占12.5%(1/8),GGT 1例占12.5%(1/8),GTT 3例占37.5%(3/8),GAT 4例占50.0%(4/8)。胰腺恶性淋巴瘤1例、胰腺多形细胞癌2例、慢性胰腺炎5例均无突变。在提出完整DNA19份标本中,Rb基因第21外显子突变的有9例,占47.4%(9/19),而胰腺恶性淋巴瘤1例、胰腺多形细胞癌2例、慢性胰腺炎5例均未见C-K-ras基因12位密码子和Rb基因第21外显子突变。

  3 讨论

  Ras癌基因家族中有三种Ras原癌基因,据报道与胰腺癌有关的是C-K-ras癌基因。Ras基因编码的蛋白质大约有90%氨基酸序列同源,分子量为21 000道尔顿,故称之为P21蛋白(Ras蛋白)。该蛋白位于细胞膜的内表面,在细胞增殖信号传导过程中起枢纽作用。许多受体都通过活化Ras蛋白而将增殖信号传入细胞内部。P21蛋白属于GTP酶超家族,能与GTP或GDP结合,并可催化GTP水解为GDP和无机磷酸,Ras基因突变在肿瘤中非常普遍。Ras基因致癌的分子基础目前认为主要是点突变。所有Ras基因点突变的位置都在第12、13、61位密码子。其中绝大多数点突变在第12位密码子。野生型P21蛋白第12位为甘氨酸,其对应的Ras基因编码链的核苷酸是GGT。K-ras基因点突变一般会出现六种类型[5]:如果核苷酸突变为CGT、TGT、AGT、GCT、GTT、GAT,12位甘氨酸分别被精氨酸、半脱氨酸、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸取代。但是较常见的突变形式依次是GAT(Asp)、GTT(Val)和GGT(Arg)。PCR-SSP检测法[6]根据K-ras基因对应的12位密码子三种主要突变形式设计的特异引物。三种编码链P1、P2、P3的3′端碱基分别对应编码链的GGT中的第一个碱基G→C、第二个碱基G→T或A,模板链为共同的引物P4。P1与P4扩增出CGT型突变,产物长89bp;P2-P4、P3-P4分别扩增出GTT、GAT型突变,产物长88bp。由于经费欠缺在设计引物时我们只设计了三种,其它三种未做。这也是我们的检测结果在胰腺癌中C-K-ras点突变发生率低的缘故,因为可能存在的其他三种突变没有设计引物故不能表现出来。还有C-K-ras点突变也发生在13和16位点;胰腺癌C-K-ras除点突变外还有别的突变类型有待进一步研究。C-K-ras突变会影响P21蛋白的构象,进而影响与鸟苷酸的相互作用。它们或者降低GTP酶的活性,不能使GTP水解为GDP,或者提高GTP取代GDP的效率,因为P21蛋白与GTP结合为活化状态,而与GDP结合则失活,结果导致P21蛋白更多的处于活化状态,并持续向细胞内发送增殖信号,促使细胞过度增殖,形成肿瘤。

  Rb基因是第一个被克隆的抑癌基因,最初发现于儿童的视网膜母细胞瘤(retinoblestoma),因此称为Rb基因, Rb基因定位于人类13号染色体q14,全长200kb,有27个外显子,26个内含子,编码具有928个氨基酸残基 (p105)。Rb蛋白可被磷酸化和去磷酸化。磷酸化的Rb蛋白是Rb基因调节细胞分化的主要形式。未磷酸化或低磷酸化的Rb蛋白是非活化型,与细胞内多种蛋白质结合,其中转录因子E-2F被Rb蛋白结合时,不能发挥转录因子的作用,其活性处于抑制状态。当Rb蛋白被磷酸化时,Rb蛋白失去结合其它蛋白能力,转录因子E-2F被释放出来,进而与特异性DNA序列结合,从而激活一系列与核酸合成有关的酶的基因表达。这些基因包括DNA聚合酶а、二氢叶酸还原酶、胸苷激酶等。Rb基因的抗癌性有两种含义:一是在正常细胞中Rb蛋白具有抑制细胞生长的作用;二是在肿瘤细胞内Rb基因具有抑制其生长及致瘤作用。利用Rb基因探讨和抗Rb蛋白的抗体检测正常人体组织及其相应的肿瘤组织,发现正常人体组织Rb基因的结构及表达均正常,而相应的肿瘤组织中的基因缺失突变,缺乏正常的Rb蛋白。人们用逆转录病毒感染的方法将正常Rb基因导入视网膜母细胞瘤、膀胱癌、肺癌等癌细胞株,结果Rb基因都可不同程度地抑制这些癌细胞株在裸鼠体内的致癌性。这些结果为Rb基因的抗癌性提供了直接的证据。

  通过检测肿瘤相关基因的结构,分析肿瘤相关基因的缺陷和表达功能,以达到肿瘤的基因诊断目的。在肿瘤的基因诊断中,PCR技术具有简单快速、特异性强、敏感性高、对样本DNA要求不高等优点。所以我们选用PCR-SSP法分析胰腺癌标本C-K-ras基因、Rb基因点突变与胰腺癌的关系,为胰腺癌的早期诊断寻找一种可行的方法。

  【参考文献】

  [1] Block A,Chen SH,Kosai K,et al.Adenoviral-mediated herpes simplex virus thymidine kinase gene transfer: regression of hepatic metastasis of pancreatic tumors [J].Pancease,1997,15(1):25-34.

  [2] 刘彤华.肿瘤病理学[M].北京:北京医科大学协和医科大学联合出版社,1997:217-249.

  [3] 张树辉.PCR及其在肿瘤病理学研究中的应用[J].临床与病理学杂志,1992,8(1):73.

  [4] 郑怀竟.基因扩增临床检验指南[M].北京:北京医科大学协和医科大学联合出版社,1998:54.

  [5] Hruban RH,van Mansfeld AD, Offerhaus GJ,et al.K-ras oncogene activation in adenocarcinoma of the human

  pancreas. A study of 82 carcinomas using a combination of mutant-enriched polymerase chain reaction analysis and

  allele-specific oligonucleotide hybridization[J]. Am J Pathol,1993,143(2):545-554.

  [6] Tada M, Omata M,Kawai S,et al. Detection of ras gene mutations in pancreatic juice and peripheral blood of

  patients with pancreatic adenocarcinoma[J]. Cancer Res, 1993,53(11):2472-2474.

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