Wnt信号途径在胃癌组织和细胞系中的活化

　　作者：韩竞春，黄磊，张开立，陈晓燕，孔庆友，孙媛，吴茉莉，李宏 作者单位：(大连大学附属新华医院 肿瘤科;大连海事大学环境生物研究所;大连医科大学辽宁省癌症基因组学重点实验室和基础医学院 生物学教研室，辽宁 大连 116021)

　　【摘要】 目的 研究Wnt通路在胃癌组织中的活化状态及其与胃癌发生发展的关系。方法 应用免疫组化、免疫荧光、RTPCR和Western蛋白印迹等方法，在胃癌组织和细胞系中检测Wnt信号途径的活化状态。结果 Wnt 2、 βcatenin和TCF4在胃癌组织中的表达明显高于癌前病变组织(P<0.01);Wnt组与Wnt-组中癌前组织和胃癌组织的分布具有显著统计学差异(P<0.001)。结论 Wnt信号通路在胃癌组织中呈活化状态，并与胃癌发生发展密切相关。

　　【关键词】 胃肿瘤;Wnt;信号传导

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(30670946)

　　Activation of Wnt Signaling in Gastric Cancer Tissues and Cell Lines

　　Han Jingchun, Huang Lei, Zhang Kaili, Chen Xiaoyan, Kong Qingyou, Sun Yuan, Wu Moli, Li Hong

　　(Department of Oncology, Xinhua Hospital Affiliated to Dalian University; Institute of Environmental Systems Biology, Dalian Maritime University;Department of Biology, Dalian Medical University, Dalian 116021, China)

　　Abstract： Objective To illustrate the activation status of Wnt signaling and its correlation with gastric carcinogenesis. Methods Immunohistochemistry, immunofluorescence, RTPCR and western blotting were adopted to detect Wnt signaling activation in the gastric cancer tissues and cell lines.Results Expressions of Wnt2, βcatenin and TCF4 were significantly higher in the cancer tissues, compared with premalignant tissues (P<0.01). The distributions of Wnt+ and Wnt-groups were significantly different in premalignant and cancerous tissues (P<0.001). Conclusion Wnt signaling is not only activated in gastric cancer tissues but associated with gastric carcinogenesis as well.

　　Key words： gastric neoplasm; Wnt; signaling

　　胃癌是我国乃至全球范围内发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一。大连医科大学辽宁省癌症基因组学重点实验室与澳大利亚墨尔本大学癌症研究中心合作，利用基因芯片杂交技术[1]，对胃癌及其相关性病变的基因表达谱进行研究发现，在胃癌的发展过程中出现了Wnt信号的异常，包括Wnt表达的频率上调[2]，以及TCF4和βcatenin的核易位[3]。本研究针对胃癌组织中Wnt传导通路关键基因及总体水平的活化状态进行探讨。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 (1)标本来源和细胞系来源：54例胃癌及癌旁组织均选自大连医科大学辽宁省癌症基因组学重点实验室建立的人胃癌组织库。胃癌细胞系AGS和HGC27购于美国ATCC(American Type Cell Culture)细胞库。MGC803(人胃低分化黏液癌)和BGC823(人胃低分化癌)从北京肿瘤研究所购进。(2)抗体：羊多克隆Wnt 2抗体，鼠单克隆βcatenin抗体，兔多克隆TCF4抗体，免疫荧光羊抗鼠抗体，免疫荧光羊抗兔抗体均为Santa Cruz(Santa Cruz，CA，USA)公司产品。

　　1.2 方法 (1)石蜡组织微阵列的制作：石蜡组织微阵列采用自制的阵列制作仪制作。(2)免疫组化染色：免疫组化试剂盒：HistostainTMplus Kits SP9003(山羊SP Kit)、SP9000(通用SP Kit)购自北京中山生物技术有限公司;按照SP试剂盒说明进行免疫组化染色。结果的判定按参考文献[4]。(3)细胞培养：①MGC803和BGC823细胞培养液：DMEM培养基，10%胎牛血清。②AGS及HGC27细胞培养液：Ham’s F12培养液， 10%胎牛血清， 根据美国ATCC推荐[5～6]。在细胞培养箱中培养细胞至80%汇合时收集细胞，提取RNA和蛋白用于实验分析。(4)RNA提取和RTPCR分析：常规Trizol法提取总RNA。反转录体系依照TaKaRa RNA LA PCRTM Kit试剂盒提供说明书进行操作，PCR引物序列(TaKaRa生物工程有限公司)见参考文献[7～10]。(5)胃癌细胞系总蛋白的提取及Western印迹分析：常规提取细胞总蛋白。Western印迹分析参照文献[11]方法进行。(6)免疫荧光：预先在培养皿底铺数张已灭菌的盖玻片(约5 mm×5 mm)，把细胞接种于皿中，等细胞均匀生长在皿底和盖玻片上时，取出盖玻片，100%冷丙酮-20 ℃ 固定，用于免疫荧光分析。 βcatenin和TCF4在细胞系中表达采用双色荧光标记法。

　　1.3 统计学方法 使用SPSS12.0版本统计软件，选用KruskalWallis检验方法。

　　2 结果

　　2.1 Wnt 2、 βcatenin和TCF4在不同病变胃组织中的表达 见表1，图1A。

　　表1 Wnt 2、 βcatenin和TCF4在不同病变胃组织中的表达(略)

　　与癌前病变组比较，①P<0.01

　　图1 Wnt途径在胃癌组织中的免疫组化(A)和细胞系免疫荧光(B)(略)

　　2.1.1 Wnt 2在胃癌组织中表达率为90.3%(28/31)，多呈现为强染色(17例)，明显高于癌前病变组织，统计学比较差异显著(P<0.01);而且Wnt 2在两种类型胃癌中表达频率均较高，两组间无统计学意义(P>0.05)。

　　2.1.2 βcatenin的核易位表达在癌前和胃癌两组间比较统计学差异显著(P<0.01)。在两种类型胃癌组织中的表达无统计学意义(P>0.05)。

　　2.1.3 在全部31例胃癌组织中均可见TCF4的表达，而且均为强阳性染色。TCF4在癌前病变和胃癌组织间的表达统计学差异显著(P<0.01)。

　　2.2 Wnt通路在不同胃组织中的分布 Wnt途径活化(Wnt+)是指同一样本中Wnt 2和βcatenin /TCF4同时呈现阳性表达;而在同一样本中上述三个关键环节不能同时表达，则视为Wnt途径处于非活化状态(Wnt-)。在实验研究中，将全部54个样本按照上述原则分为Wnt组和Wnt-组，探讨它们在不同病变胃组织中的分布。54例样本中，29例存在Wnt通路活化(Wnt组)，其中27例(93.1%)为胃癌组织，癌前病变组织仅有2例(6.9%);25例Wnt通路非活化组(Wnt-组)中，21例为癌前病变组织(84.0%)，而仅有4例(16.0%)为胃癌组织。在Wnt组与Wnt-组中癌前组织和胃癌组织的分布具有显著统计学差异(P<0.001)。

　　2.3 胃癌细胞系中Wnt信号途径活化 免疫荧光结果显示βcatenin /TCF4的核易位出现在MGC803和BGC823细胞系中(见图1B)。RTPCR和Western蛋白印迹结果Wnt 2、βcatenin和TCF4在四个胃癌细胞系中的表达情况见图2。

　　图2 胃癌细胞系中的Wnt通路RTPCR和Western blotting结果(略)

　　3 讨论

　　Wnt信号通路不仅对正常胚胎发育起着重要作用，而且Wnt信号通路的不恰当激活将导致细胞恶性转变和肿瘤发生[12～13]。在Wnt途径中，Wnt信号和βcatenin/TCF复合体被认为是Wnt信号途径活化的关键因子。Wnt家族有19个成员，胃癌中以Wnt 2的表达更为常见[8]。就胃癌而言，目前现有的研究多着眼于Wnt途径中Wnt 2，或βcatenin，或TCF4等几个关键环节，并以其中某个环节的改变来代表整条Wnt途径的活化，而针对Wnt传导通路总体水平的活化状态与胃癌及靶基因表达相互关系的研究尚未见报道。

　　本实验首先应用本研究所自制的石蜡组织微阵列芯片和免疫组化染色方法，同时检测Wnt 2、βcatenin和TCF4在不同病变胃组织的表达情况。结果显示，与癌前病变组织相比，Wnt途径的关键因子Wnt 2，βcatenin和TCF4在胃癌组织中均呈高表达状态，表明这些Wnt途径的关键因子的表达与胃癌的发生发展关系密切。在胃癌组织中Wnt通路多呈活化状态;在癌前病变组织中，虽然存在Wnt途径的部分因子的表达(即表现为或Wnt 2或βcatenin/TCF4的表达，而不存在同时表达)，但在这些组织中却几乎没有激活的Wnt通路。这也证明了Wnt信号通路的激活与胃癌密切相关，可能在胃癌的发生发展中起重要作用;而利用胃癌细胞系的研究也发现了存在Wnt信号通路的活化。因此，Wnt信号通路的活化可能是导致胃癌组织中相关基因表达的重要因素。2007年2月 第36卷 第1期临 床 军 医 杂 志 (Clin J Med Offic)

　　当然，Wnt信号通路活化将导致其下游靶基因状态的改变，但目前对Wnt传导通路的活化状态与下游各基因表达相互关系尚缺乏系统的分析，需要更为直接的证据去证实Wnt活化与胃癌发生发展的关系，而四个胃癌细胞系为我们提供了理想的体外实验模型。

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