survivin启动子的克隆及其在前列腺癌细胞系中的活性鉴定

　　作者：骆晓梅，张南征，刘家云，苏明权，郝晓柯 作者单位：国家自然科学基金(30500433) 中国人民解放军第九七医院检验科，江苏徐州221004;中国人民解放军第九七医院消化内科;第四军医大学西京医院全军临床检验医学中心，陕西西安710032

　　【摘要】 目的 克隆survivin启动子片段，并检测其在人前列腺癌细胞中的转录活性，为该启动子在前列腺癌靶向基因治疗中的应用提供实验依据。方法 PCR方法扩增survivin基因启动子S1pro和S2pro，克隆入pGL3-Basic，分别构建重组质粒pGL3-S1pro和pGL3-S2pro，脂质体转染前列腺癌细胞和Chang liver肝细胞，检测survivin启动子在细胞中的转录活性。结果 survivin基因启动子在前列腺癌细胞中均具有较强活性，其中S2pro活性明显高于S1pro，达到CMV启动子活性的三分之一。结论 survivin启动子在前列腺癌细胞中具有较强启动活性，有可能成为新的前列腺癌靶向性基因治疗工具。

　　【关键词】 前列腺癌;基因;survivin;启动子;基因治疗

　　Cloning of tumor-specific survivin promoter and the identification of its transcriptional activities in human prostatic carcinoma

　　LUO Xiaomei, ZHANG Nanzheng, LIU Jiayun, SU Mingquan, HAO Xiaoke

　　(Department of Clinical Laboratory, The 97th Hospital of PLA, Xuzhou, Jiangsu 221004, China; Department of Gastroenterology, The 97th Hospital of PLA, Xuzhou, Jiangsu 221004; Center of Clinical Laboratory Medicine of PLA, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University， Xi′an, Shanxi 710033)

　　Abstract: Objective To clone DNA sequence of survivin promoter, and detect its transcriptional activities in human prostate cancer cells. Methods The fragment of survivin promoter was acquired by PCR amplification and was inserted into pGL3-Basic to reconstruct recombinant plasmids pGL3-S1pro and pGL3-S2pro, respectively. The reconstructed plasmids were transiently transfected into human prostate cancer cell lines LNCap, PC-3 and normal Chang liver cells. The transcriptional activities of survivin promoter in various cel1s were determined by detection of the expression of luciferase. Results Survivin promoter had transcriptional activities in all prostate cancer cell lines and the transcriptional activity of the S2pro was much higher than the S1pro and reached a level of one third of the transcriptional activity of the CMV promoter. Conclusion The survivin promoter cloned in this study was more highly activated in prostate cancer cells than in normal cel1s, which might enable it to be a potential candidate promoter in the gene therapy of prostate cancer.

　　Key words: prostate cancer; gene; survivin; promoter; gene therapy

　　随着现代分子生物学技术的发展，靶向性基因治疗已成为前列腺癌治疗研究的热点，而寻找高效特异的启动子则是基因治疗研究的关键。本实验通过构建survivin基因启动子调控的真核表达载体,转染前列腺癌细胞，探讨并评价survivin启动子作为前列腺癌特异性启动子的可能性，为进一步将其应用于前列腺癌靶向基因治疗研究打下基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic、含有CMV启动子的p3.1-LUC(张翔等构建[1])、前列腺癌细胞系LNcap、PC-3和正常肝细胞系Chang liver均购自中科院上海细胞所，本室保存。DNAZOL和RPMI 1640为Gibco公司产品;DNA聚合酶、SacⅠ、HindⅢ和T4 DNA连接酶为Takara公司产品;脂质体Lipofectamine 2000为Invitrogen公司产品;质粒纯化试剂盒及胶回收试剂盒为Promega公司产品。其他试剂均为国产或进口分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 survivin基因启动子引物的设计和合成 根据GenBank中survivin启动子序列及引物设计原则，设计survivin启动子两对引物，分别扩增survivin启动子基因片段S1(第-268～+1位)和片段S2(第-268～+30位)。上、下游引物5′端分别含有pGL3-Basic载体多克隆位点中包含的SacⅠ和HindⅢ限制性内切酶序列。上游引物P1，5′-ACGGTCGACCGCGTTCTTTGAAAGCAGTC-3′。下游引物分别为：P2，5′-TATAAGCTTTGCCGCCGCCGCCACCTCT-3′;P3，5′-TATAAGCTTCCAGGCAGGGGGCAACGT-3′。引物由北京奥科生物技术公司合成。

　　1.2.2 PCR扩增及鉴定 DNAZOL自LNcap细胞提取基因组DNA，以此为模板进行聚合酶链反应(PCR)，分别扩增survivin启动子S1和S2片段。反应条件为：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸60 s，30个循环，72℃延伸7 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收试剂盒回收得到survivin启动子片段。与pMD18-T测序载体连接，送北京奥科生物技术公司测序。

　　1.2.3 pGL3重组质粒的构建 SacⅠ和HindⅢ双酶切测序正确的含有survivin启动子的pMD18-T载体和pGL3-Basic载体，回收的片段用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞,在Amp抗性平板上筛选重组质粒。用SacⅠ和HindⅢ双酶切鉴定并送公司DNA测序。测序正确的重组质粒命名为pGL-S1pro、pGL-S2pro。

　　1.2.4 重组质粒的活性分析 分别将pGL-S1pro、pGL-S2pro、p3.1-LUC及阴性对照质粒pGL3-Basic转染前列腺癌细胞系LNCaP、PC-3和正常肝细胞系Chang liver，以未转染质粒的细胞为未转染对照组，同步进行实验。各组同时转染含有海肾荧光素酶的载体pRL-TK为内参照。各转染组每孔质粒用量为0.8 μg，同时各孔加入pRL-TK 0.1 μg，脂质体用量为2 μl，每组设3个平行孔。培养48 h后裂解细胞，加入荧光素酶检测试剂，在TD-20/20荧光检测仪上对荧光作定量测定。为消除转染效率带来的影响，同时转染pRL-TK质粒检测光密度(D)以校正转染效率。

　　2 结果

　　2.1 PCR扩增 S1全长为269 bp，S2全长为298 bp。2%琼脂糖凝胶电泳检测结果中可见清晰的扩增条带，片段大小与预计相符(图1-A)。

　　2.2 重组质粒pGL-S1pro和pGL-S2pro的鉴定 经SacⅠ、HindⅢ双酶切后分别可见到大小约270 bp和300 bp的survivin启动子基因片段(图1-B)。结果与设计相符，测序结果与目的基因组一致

　　图1 电泳结果(略)

　　M. DNA Marker; 1. S2pro; 2. S1pro　a. pGL-S1pro; b. pGL-S2pro

　　2.3 重组质粒荧光素酶活性分析 荧光定量测定结果表明：带有CMV启动子的阳性对照载体p3.1-LUC质粒转染所有细胞48 h后，荧光素酶活性均达到较高水平;携带有survivin基因启动子的重组质粒转染细胞48 h后PC3和LNCap细胞中，荧光素酶活性也均达到较高水平，但比CMV启动子仍为低，其中pGL3-S2pro较pGL3-S1pro活性强，接近CMV启动子活性的30%，pGL3-S1pro活性仅为pGL3-S2pro活性的20%～30%;而在正常肝细胞系Chang liver中荧光素酶活性均很低，与pGL3-Basic无显著差别。见图2。

　　图3 重组质粒在各细胞中的荧光素酶活性比较(略)

　　3 讨论

　　在肿瘤的基因治疗中，为了能使杀伤基因选择性地表达于肿瘤靶细胞中, 准确地杀伤肿瘤细胞,保护正常组织细胞, 对目的基因表达于肿瘤细胞的特异性提出了更高的要求。survivin是近年来发现的一种具有肿瘤特异性表达的细胞凋亡抑制因子[2]。Bao等[3]证实survivin蛋白在肿瘤组织中的表达调控发生在转录水平,在具有高度增殖活性的肿瘤细胞中高表达，但在终末分化的正常组织细胞中不表达[4]。survivin启动子在人类恶性黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、胶质瘤细胞中具有相当高的活性,而在正常细胞中相当低[5]。利用survivin启动子构建的可复制腺病毒,在众多的癌组织中表现出肿瘤特异性和高效的病毒复制功能[6]。另外，研究表明众多实体肿瘤的转移与缺氧有关，而survivin启动子在低氧条件下仍具有活性，这进一步说明survivin启动子很可能成为特异性基因治疗的候选基因[7]。Van Houdt等[8]克隆了survivin基因起始密码子上游第-230～+30位和第-1430～+30位两个survivin启动子基因片段，证实两者在转录活性、杀灭肿瘤细胞效果、体内抑瘤效果等方面没有显著差异。在实验构建的载体中，重组入的片段过长会使载体的结构发生变化，可能影响预期功能的完成。而survivin全长的启动子已达1.5 kb左右，若要完成预期作用则启动子后面的功能基因片段长度则可能受到限制，有时无法满足实验的需要。Li等[9]报道survivin基因起始密码子上游第-268～+1位片段已具备启动子功能。

　　为了既能够使survivin启动子的功能得到充分发挥又不限制其他功能基因组的长度，使其功能基因组也可正常发挥其功能，本研究从LNCap细胞基因组中克隆出S1(第-268～+1位)和S2(第-268～+30位)两个survivin启动子片段，转染前列腺癌雄激素依赖的LNCap细胞和雄激素非依赖的PC3细胞，并以正常肝细胞Chang liver作为对照。结果发现，两个survivin启动子在前列腺癌细胞中均显示了良好的转录活性，而在Chang liver细胞中活性极低。同时发现，虽然S1和S2只相差30个碱基，但转录活性差别较明显，S2的转录活性明显比S1的活性强，这可能是在序列+1～+30间有一定的结构维持其功能更好的发挥。

　　另一方面， 本实验克隆的survivin启动子转录活性均比非特异性的CMV启动子活性弱，这正是肿瘤特异性启动子的限制之一。但是实验也提示了CMV启动子在Chang liver细胞也有较高的活性，这就提示了在基因治疗中若启动子后携带自杀基因等有毒性基因时，如使用CMV启动子等目前常用的一些非肿瘤特异性启动子则可能会对正常组织细胞造成一定的影响。而survivin启动子在Chang liver细胞几乎无活性，表现了较好的肿瘤特异性。

　　同时发现，survivin启动子在前列腺癌雄激素依赖和非依赖细胞系中均能良好的转录，与前列腺特异性抗原(PSA)和前列腺特异性膜抗原(PSMA)的激素选择性相比，克服了它们的启动子在前列腺癌治疗中雄激素选择性给基因治疗带来的困难。

　　本实验的结果提示，survivin启动子仅特异性地作用于肿瘤细胞,实现了肿瘤基因治疗的特异性,有望在前列腺癌基因治疗中提高安全性、特异性,降低毒副作用等方面提供新思路。

　　【参考文献】

　　[1] 张翔,郝晓柯,刘家云,等.Probasin启动子的克隆及其在不同肿瘤细胞系中的表达活性[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2007,14(3):287-290.

　　[2] Zaffaroni N, Pennati M, Daidone MG. Survivin as a target for new anticancer interventions [J]. J Cell Mol Med,2005,9(2)：360-372.

　　[3] Bao R, Connolly DC, Murphy M, et al. Activation of cancer-specific gene expression by the survivin promoter [J]. J Natl Cancer Inst,2002,94(7)：522-528.

　　[4] Konno R, Yamakawa H, Utsunomiya H, et al. Expression of survivin and Bcl-2 in the normal human endometrium [J]. Mol Hum Reprod,2000,6(6):529-534.

　　[5] Zhu ZB, Makhija SK, Lu B, et al. Transcriptional targeting of tumors with a novel tumor-specific survivin promoter [J]. Cancer Gene Ther,2004,11(4):256-262.

　　[6] Kamizono J, Nagano S, Murofushi Y, et al. Survivin-responsive conditionally replicating adenovirus exhibits cancer-specific and efficient viral replication [J]. Cancer Res,2005,65(12):5284-5291.

　　[7] Yang L, Cao Z, Li F, et al. Tumor-specific gene expression using the survivin promoter is further increased by hypoxia [J]. Gene Ther,2004,11(15):1215-1223.

　　[8] Van Houdt WJ, Haviv YS, Lu B, et al. The human survivin promoter: a novel transcriptional targeting strategy for treatment of glioma [J]. J Neurosurg,2006,104(4):583-592.

　　[9] Li F, Altieri DC. Transcriptional analysis of human survivin gene expression [J]. Biochem J,1999,344(Pt 2):305-311.