不同照射模式对人鼻咽低分化鳞癌细胞株CNE2放射敏感性的影响研究
发表时间：2010-08-12 浏览次数：337次
作者：黄莉, 王若峥, 李品东 作者单位：(新疆医科大学附属肿瘤医院放疗一科, 新疆乌鲁木齐 830011)
【摘要】目的：探索不同照射模式对人鼻咽低分化鳞癌细胞株(CNE2)放射敏感性的影响。方法：运用克隆形成实验(courtenay assay)，检测不同照射模式下CNE2细胞的存活分数(SF)，拟合细胞存活曲线。并运用四氮唑蓝法(MTT)进一步验证克隆形成实验的结果。结果：分别给予CNE2细胞 0、1、2、4、6、8 Gy的照射后，CNE2细胞的SF值随照射剂量增加逐渐下降，并且在相同的剂量点，模拟调强照射(IMRT)组的SF均高于常规照射组;根据线性二次方程拟合CNE2细胞存活曲线，α常规>αIMRT，β常规>βIMRT，N常规
【关键词】 CNE2; IMRT; 存活分数; 放射敏感性;
Radiosensitivity effect of different radiation pattern on human cell strain (CNE2) of poor differential nasopharyngeal squamous cell carcinoma
HUANG Li, WANG Ruozheng, LI Pindong
(Department of Radiation Oncology, Affiliated Tumor Hospital Xinjiang Medical University,Urumqi 830011, China)
Abstract: Objective: To explore the influence of different radiation pattern on radiosensitivity in cell strain (CNE2) of nasopharyngeal squamous cell carcinoma. Methods: Surviving fraction(SF) was analyzed by courtenay assay, fitting cell survival curve; Cell growth inhibition was measured by MTT. Results： There were some different radiation doses including 0, 1, 2, 4, 6, 8 Gy, SF was decreasing with the radiation dose rised. Compared with simulation IMRT (SIMRT) group, SF of convention radiation (CR) group was lower in every dose point; Fitting cell survival curve by linear quadratic equation and multitarget oneshot model, αCR>αSIMRT, βCR>βSIMRT, NCR
Key words: CNE2; intensitymodulated radiation therapy; surviving fraction; radiosensitivity
鼻咽癌是人类常见的恶性肿瘤之一，尤其在我国南方高发，放射治疗作为其首选治疗。放射治疗做为肿瘤治疗的三大手段之一，随着放射治疗技术的发展，传统常规放射治疗已有许多的不足，而调强放射治疗(intensitymodulated radiation therapy IMRT)做为临床肿瘤放射治疗走向精确定位、精确计划设计、精确治疗的标志，突破了传统常规放疗的规则大野照射，以不规则的多个子野从多个角度在保护危及器官及正常组织的同时，最大限度的给予肿瘤区域以较高剂量照射;同时还实现了补量技术，在治疗次数相同的情况下，给不同的靶区不同剂量，以期提高局控率并减少周围正常组织损伤。但是由于IMRT治疗技术的复杂性使其在常规照射时一次性给予的剂量分成了间隔一定时间的多次给予，尤其是多叶光栅准直(multileaf collimated，MLC)静态调强技术大大延长了照射时间，使得单位时间内肿瘤吸收剂量大大降低。根据Elkind[1]的亚致死性损伤修复(SLDR)的理论，有学者推测IMRT照射时间延长，可能导致生物效应降低，但其确切影响仍不清楚。放射治疗模式的改变是否会影响肿瘤细胞的生物效应尚未明确，是否要对IMRT照射模式进行剂量的补偿亦尚未定论。本研究旨在通过给予人鼻咽低分化鳞癌细胞株(CNE2)不同模式照射，探索IMRT治疗模式对CNE2放射敏感性的影响。
1资料与方法
1.1细胞来源及培养条件人鼻咽低分化鳞癌细胞株(CNE2)购自中山大学实验动物中心，培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，另添加谷氨酰胺(2 mmol/L)和抗生素(100 U/L青霉素和100 mg/L链霉素)，置于37℃、含5% CO2气体的培养箱中培养。
1.2主要试剂优级胎牛血清(美国Sigma公司)，RPMI1640培养基(美国Hyclone公司)，青、链霉素(美国Sigma公司)，胰蛋白酶(华美生物工程公司)，乙二胺四乙酸(EDTA，美国Sigma公司)，苏木精(美国Amresco公司)，四氮唑蓝(MTT，美国Amresco公司)，二甲基亚砜(DMSO，加拿大BBI公司)。
1.3细胞传代当细胞80%长满或接近汇合成片时，进行传代。吸出培养瓶内旧培养液，用PBS冲洗后加入0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA溶液少许进行消化，以能覆满瓶底为限。室温中，于倒置显微镜下观察，当发现细胞胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。吸除消化液，加入培养液，用吸管吸取培养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱落形成细胞悬液。将细胞悬液分为2等份装入两个培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5%CO2恒温培养箱继续常规贴壁培养。
1.4细胞分组及照射方式贴壁生长的CNE2细胞消化后制成单细胞悬液，用于细胞分组。实验分为空白对照组、常规照射组、模拟IMRT组。空白对照组不接受照射;常规照射组剂量率为3 Gy/min，1、2、4、6、8 Gy五个剂量点分别照射，1～3 min完成;模拟IMRT组剂量率为3 Gy/min，1、2、4、6、8 Gy五个剂量点分别等分分割5次，每次间隔8～8.5 min，35 min照射完成。采用美国Varian直线加速器1、2、4、6、8 Gy单野照射(射线种类及能量：6MV X线，射野25 cm×25 cm，SSD=100 cm，机架角180度，下垫1.5 cm等效膜)。照射结束后，置于37℃、含5% CO2气体的培养箱中培养。
1.5克隆形成实验各组各个剂量点分别设3个平行样本，0、1、2、4、6、8 Gy6个剂量点分别接种1 000、1 000、2 000、4 000、6 000、10 000个细胞于75 ml一次性培养瓶中，并加入含10%灭活胎牛血清的RPMI1640培养基6 ml，5%CO2培养箱内37℃静置过夜。细胞贴壁后分别接受Varian加速器1、2、4、6、8 Gy单野照射。照射结束后置于37℃、含5% CO2气体的培养箱中继续培养。10 d后倾倒培养液，将细胞置于通风处风干15 min，95%酒精固定细胞;加入无杂质的苏木精进行细胞核染色。染色后用自来水冲洗培养瓶，去除残余苏木精;显微镜下计算每个克隆中细胞个数(图1)。取大于50个细胞的克隆数作为照射结束后存活的细胞个数。并计算照射结束后细胞存活分数(SF)=受照射细胞的克隆形成率PE /对照细胞的克隆形成率PE)，PE=大于50个细胞的克隆数/接种细胞个数。按公式计算存活分数，计算这2株细胞2 Gy的存活分数(SF2)。独立性实验重复3次。
图1CNE2细胞克隆形成实验流程示意图(略)
1.6四氮唑蓝实验将细胞接种于96孔板，每孔约3×103个细胞。细胞贴壁后分别接受0、2、4、6、8 Gy剂量照射，照射后置于37℃、含5% CO2气体的培养箱中培养12 h。12 h后，每孔加入50 μl MTT(5 mg/ml)，37℃、 5%CO2条件下继续培养4 h;4 h后吸净每孔中的MTT液，加入DMSO150 μl，室温放置20 min，轻轻振摇10 min使蓝紫色结晶物充分溶解。在酶标仪540 nm处测定各组光密度值(optical density value，OD值)。以照射剂量为横坐标，OD值为纵坐标绘制细胞增殖曲线。独立性实验重复3次。
1.7统计分析集落计数后采用GRAPHPAD Prism 4.0软件根据LQ模型公式拟合曲线，并计算LQ模型相关参数。统计数据用均数±标准差(±s)表示。
2结果
2.1细胞培养瓶及细胞集落形态克隆形成实验所用培养瓶及染色后的显微镜下的癌细胞集落形态，集落呈椭圆形，细胞可见核分裂相，细胞数<50(图2)。
2.2克隆形成实验计算不同照射模式CNE2细胞的SF分别给予CNE2细胞0、1、2、4、6、8 Gy照射后，CNE2细胞的SF值随照射剂量增加逐渐下降，并且在相同的剂量点，模拟IMRT组的SF均高于常规照射组。模拟IMRT组与常规照射组CNE2细胞 SF2分别为(0.335±0.017)、(0.225±0.018)，模拟IMRT组SF2是常规照射组的1.49倍(表1)。
图2克隆形成实验所使用的细胞培养瓶及染色后集落形态(略)
表1克隆形成实验计算不同照射模式CNE2细胞的SF(略)
2.3Kellerer和Rossi的线性二次方程拟合的不同照射模式下CNE2细胞的细胞存活曲线CNE2α/β值为13.177Gy，模拟IMRT组与常规照射组的α、β、N、D0、Dq值均不相同，α常规>α模拟IMRT，β常规>β模拟IMRT，N常规
表2不同照射模式下CNE2细胞经多靶单击模型及线性二次方程拟合的各项参数(略)
2.4MTT检测不同照射模式CNE2细胞的增殖比例分别给予CNE2细胞 0、2、4、6、8 Gy的照射，随着剂量的增加，2组CNE2细胞增殖比例逐渐下降，到8 Gy时最为显著。在相同的剂量点，模拟IMRT组的增值比例均高于常规照射组(表3、图4)。
图3不同照射模式下CNE2细胞的细胞存活曲线(略)
图4不同模式照射后不同剂量点各组CNE2细胞的增殖状态(略)
表3不同照射模式下CNE2细胞增殖比例比较(略)
3讨论
鼻咽癌具有独特的生物学特性，由于鼻咽解剖位置的特殊性，周围有许多放射危险或敏感器官如脑干、脊髓、颞叶、腮腺、晶体、视交叉等需给予保护，靶区体积大而不规则。因此，IMRT技术较早较广泛的被应用于鼻咽癌放射治疗实践中。多数细胞损伤修复的机制至少有两种，即慢修复与快修复两种机制，快修复的半修复时间多在0.08～1.2 h，慢修复的半修复时间多在2.4～6 h，所以多数组织的半修复时间是由平均半修复时间在0.3 h的快修复和平均半修复时间在4 h的慢修复混合而成[2]。由于IMRT放射治疗单次分割照射时间的延长，根据Elkind[1]的SLDR的理论，必然会导致照射过程中细胞SLDR的增多，从而导致其生物效应下降。
3.1不同照射模式对CNE2 细胞SF的影响目前测定细胞辐射敏感性的常用方法是克隆形成实验，可真实地反映照射后细胞存活分数(SF)。众多文献报道，克隆形成实验是目前放射生物研究的“金标准”[3～5]。Wang等[6]运用线性二次模型(Linearquadratic modol，LQ模型)计算不同IMRT照射计划(分次照射时间从瞬间到45 min完成)下细胞杀伤效率，并与常规外照射相比较。结果显示，分次照射时间在15～45 min会显著降低细胞杀伤率，认为在α/β值低和半修复时间短的肿瘤，分次照射时间的延长会明显影响IMRT的治疗效果。Zheng等[7]研究结果也提示生物效应的差异主要与α/β相关。Mu等[8]用中国仓鼠纤维母细胞(V79379A)模拟临床IMRT照射模式，分次剂量为2、8 Gy，细胞存活曲线和修复动力学参数均由实验得出，并将其同从目前广泛使用的LQ模型方程所计算的值进行比较。其结果显示随分次照射时间的延长，实验所测的SF2比例增加超过理论计算，认为延长常规分次剂量(2 Gy)照射时间的影响被LQ模型生物模式所低估。Sterzing等[9] 采用人淋巴母细胞(TK6)和人黑色素瘤细胞(MeWo)，对单次分割照射时间延长和单次分割照射野的数目及其剂量对IMRT生物效应的影响进行了研究。结果显示：分次照射时间延长超过15 min随分割照射的时间延长其细胞存活分数增加.分次照射时间相同，随着子野数目的增多，模拟IMRT模式的生物学效应有降低趋势。而夏云飞等[10]研究了14个NPC细胞株发现α/β值从0.007～13.96，在照射时间延长条件下细胞存活分数都受到影响。本实验结果显示：CNE2的SF值随照射剂量增加逐渐下降，并且在相同的剂量点，模拟IMRT组的SF均高于常规照射组。根据线性二次方程拟合的CNE2细胞存活曲线，α常规>αIMRT，β常规>βIMRT，N常规
3.2不同照射模式对CNE2细胞增殖比例的影响近几年来关于MTT法能否应用于放射敏感性检测的争论很多[3,11,12]。由于MTT 法等为代谢法，只要有DNA合成就可以显示，而照射后细胞可有2～3次有丝分裂，这一点通过MTT法等可能无法区分准确，但这是照射后造成的“细胞存活假象”，这些细胞没有无限繁殖能力，也不能形成集落。所以，虽然MTT 法所测值均高于克隆形成法，但是仍可间接反映细胞存活数量。李莉等[5]用0～10 Gy不同剂量γ射线照射人脑胶质瘤细胞SHG44后，检测其SF，发现照射剂量<3 Gy时上述两种方法存活曲线重合性较好，照射剂量>3 Gy时MTT法所测数值均略高于克隆形成法。石卫民等[13]认为，两法测定的SF相关性较好。说明MTT法在一定程度上能代替克隆形成实验进行肿瘤细胞辐射敏感性的测定。有学者用克隆形成实验得出HepG2、EC9706和MCF7的SF分别为0.45、0.47和0.74[13～15]。王芹MTT实验结果与之相符[16]。本实验结果显示：CNE2的增殖比例随照射剂量增加逐渐下降，并且在相同的剂量点，模拟IMRT组的增殖比例均高于常规照射组。与克隆形成实验比较，在相同剂量点下，MTT增殖比例高于克隆形成实验，与上述报道结果类似[5，11]。同时进一步验证了IMRT时间延长将影响肿瘤的放射生物效应。综上所述，在鼻咽癌的IMRT工作实践中，应尽量采用动态IMRT技术，在合理的剂量分布的前提下尽量减少子野数目，从而减少单次照射所需要花费的时间。对于无法避免的照射时间延长的情况，应该考虑适当的进行剂量补偿。用IMRT 同时实施非均一剂量照射，即同时整合加量( simultaneous intergrated boost ，SIB )不失为一个好的选择，在不增加总时间的情况下，可明显提高大体肿瘤体积的照射剂量，增加肿瘤区域的生物剂量。
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