肺癌Fas 表达水平与抗Fas 治疗生物学效应关系的研究

　　作者：李虹， 郑世营， 赵军， 蒋东， 张晓膺 作者单位：1苏州大学附属第一医院老年医学科， 苏州 215006; 2苏州大学附属第一医院; 3苏州大学附属第三医

　　【摘要】 目的：研究肺癌细胞表面Fas 表达水平与抗Fas治疗生物学效应之间的关系。方法：将低表达Fas 的肺癌细胞A-549细胞通过脂质体介导的方法转染Fas基因，并用流式细胞直接免疫荧光术检测Fas的表达;采用鼠抗人Fas单克隆抗体 DX-IgG1κ诱导转染Fas 基因的和未转染Fas 的A-549细胞的细胞凋亡作用,并用碘化丙啶染色流式细胞术检测。结果：转染Fas基因后的A-549细胞Fas分子表达明显增加,Fas分子表达率从26. 11%增加到68.69%;鼠抗人Fas单克隆抗体DX-IgG1κ诱导的转Fas基因的A-549细胞凋亡数明显增多,达66.3% ,而未转基因的A-549细胞凋亡较少,仅7.4%。结论：人类恶性肿瘤细胞系对Fas抗体触发凋亡信号的敏感性主要依赖于细胞表面Fas的表达水平。

　　【关键词】 肺肿瘤;Fas;凋亡

　　Anti-Fas on lung carcinoma cell line A-549 :level of Fas is a predictive marker of

　　biological responsiveness

　　LI Hong, ZHENG Shiying, ZHAO Jun, et al. (Department of Geriatrics, The First Affiliated Hospital of Suzhou University,Suzhou, 215006)

　　[Abstract] Objective：To investigate the relationship between expression level of Fas and anti-Fas biological responsiveness. Methods：With direct immunofluorescence flow cytometry, expression of Fas was detected in lung carcinoma cell line A-549 transfected and untransfected with Fas gene. Apoptosis was induced with anti-Fas antibody DX-IgG1κ and measured by flow cytometry. Results：Expression of Fas was increased significantly, positive cell number increased from 26.11% to 68.69%; Apoptosis induced with anti-Fas antibody DX-IgG1κ(in lung carcinoma cell line A-549 transfected with Fas gene) reached 66.3%, significantly highier than that in lung carcinoma cell line A-549 untransfected(7.4%). Conclusion：The sensitivity of human malignant cell to Fas-mediated apoptosis is mainly dependent on the expression of Fas.

　　[Key words] Lung neoplasms;Fas;Apoptosis

　　Fas是近年发现的细胞凋亡信号受体,当与其特异性配体(FasL)结合后,可以传导凋亡信号,诱导Fas 所在细胞的凋亡[1] 。肿瘤细胞对Fas/FasL系统介导凋亡的敏感程度是由许多因素决定的,涉及到许多调控机制。细胞表面表达有功能的Fas分子并达到一定水平是经由Fas/FasL系统途径进行凋亡作用的重要因素[2]。我们通过对肺癌细胞株A-549转染Fas基因后Fas表达水平增加,观察Fas表达水平对Fas 抗体诱导凋亡作用的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 细胞、培养条件及基因转染方法 人肺癌细胞株A-549由中科院上海细胞所提供。RPMI-1640含有16% FCS，10 mmol/L Hepes 和2 mmol/L谷氨酰胺的培养液培养于37 ℃的CO2 孵箱内。培养细胞复苏后在4 周内用于实验研究。

　　脂质体介导的转染技术：将对数生长期的A-549肺癌细胞常规消化传代培养，37 ℃，18～24 h后，使细胞达到30%～50%融合;无菌制备A 液：经聚乙二醇法纯化的真核表达Fas 质粒pCMV-Fas(深圳晶美公司提供)2 μg + 100 μl 无血清RP-MI21640;B 液: 5～20 μl Lipofectin 2000 + 100 μl 无血清RPMI-1640;轻混A、B 液,室温静置10～15 min;用无血清培养液洗细胞2～3 次;将A、B 混合液1.8 ml无血清培养液轻轻混加到细胞上;孵育6～12 h;用含FCS的全培养液换液,继续培养48 h;稀释后传代到选择培养基中( G418浓度为800 μg/ml);每5～7 天换液1次并密切观察细胞生长状态;14～20天可见有细胞克隆长出，继续培养，待克隆长到较大肉眼可见，直径约1～2 mm时，将克隆灶移入96 孔板,长满后再移入24 孔板,最后在培养瓶中扩增培养,传代建系。

　　1.2 流式细胞术检测Fas 的表达 采用直接免疫荧光法流式细胞术检测细胞表面Fas 的表达。FITC 标记的小鼠抗人Fas IgG1κ DX-型抗体购自美国Pharmingen 公司。同时做同型阴性对照反应,用同样浓度的无关小鼠IgG1-FITC 代替DX-IgG1-FITC。采用Becton Dickinson 流式细胞仪和CELL Quest 配对软件分析。死细胞及细胞碎片直接从细胞窗去除,每份标本分析104 个细胞,细胞表面荧光指数(SFI) 为特异Fas抗体染色的平均荧光强度值除以同型阴性对照抗体的平均荧光强度值。阳性细胞百分率直接从门控直方图中计算。A-549细胞经确定转染Fas后于2、5、8 h检测细胞凋亡情况。

　　1.3 Fas抗体诱导细胞凋亡 采用鼠抗人Fas 单克隆抗体DX-IgG1κ(深圳晶美公司提供)诱导培养细胞凋亡。所用抗体浓度均为5 μg/ml , 并加入蛋白A(终浓度为5 μg/ml)和CHX(终浓度为10 μg/ml)。每种细胞在加处理因素之前细胞数约为5×105，约达到70%～80%融合。将抗体加入培养细胞共同作用24 h后，收集全部细胞进行检测。

　　1.4 碘化丙啶(PI) 染色流式细胞术检测细胞凋亡 用80%的乙醇或细胞保存液固定细胞(包括离壁细胞)>12 h;800～1000 r/min 离心5 min ,弃掉固定液后，PBS洗1次;800～1000 r/min 离心5 min 后弃上清液，加入无DNA 酶的RNA 酶25 μl(2 mg/ml 的RNA 酶，用PBS 配制，100 ℃ 15 min，-20 ℃保存) ;室温30 min 后加入PBS 175 μl 和PI工作液250 μl (用蒸馏水溶解PI，配成1 mg/ml溶液,用时以PBS 10 倍稀释)，4 ℃ 20 min 后上机分析。通过分析亚二倍体核来判定凋亡细胞数量[3]。

　　1.5 Western blot检测caspase-3表达及活性 蛋白的提取及Western blot分析：参照文献[4]方法提取转基因前、后的A-549l和A-549/Fas细胞的胞浆蛋白，核蛋白提取参照文献[3]方法进行，以Actin的水平作为等量蛋白质上样对照。比较A-549l和A-549/Fas细胞中凋亡效应蛋白caspase-3的底物PARP的表达。

　　1.6 统计学方法 应用SPSS 10.0统计软件，采用t检验及相关分析对实验数据进行统计学处理，P<0.01示差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　用脂质体介导的基因转染方法成功地将Fas表达质粒pCMV-Fas 转入肺癌细胞系A-549 ,筛选出阳性克隆。将未转染及转染Fas 基因的膀胱癌细胞系A-549细胞分别进行直接免疫荧光法流式细胞术,检测细胞表面Fas的表达情况,结果表明转染后的A-549J细胞Fas分子，Fas分子表达率从26.11%增加到68.69%。收集经鼠抗人Fas单克隆抗体DX-IgG1κ处理过的未转基因的A-549细胞和转Fas基因的A-549细胞的全部实验细胞,包括离壁悬浮的细胞。按前述方法进行PI染色、流式细胞术分析。结果表明转Fas基因的A-549细胞凋亡数明显增多,达66.3%;而未转基因的A-549 细胞凋亡较少,仅7.4%(图1)。

　　转基因后A-549/Fas肺癌细胞和凋亡率之间的相关关系分析显示，两者呈显著正相关关系(相关系数r=0.647，P<0.01)(表1)。

　　Western blot显示转基因前、后caspase-3的底物PARP的改变：转基因后，A-549/Fas细胞的核提取物中出现了85 kDa的PARP的分解片段，而A-549细胞中该片段含量明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)(见图2)。

　　3 讨 论

　　Fas/FasL系统在恶性肿瘤中的生物学作用还没有完全了解,但它在凋亡中的作用表明了它可以作为肿瘤生长的抑制因子。根据Fas信号可以诱导某些肿瘤细胞凋亡的特点,利用特异性抗体或配体作为拮抗剂,可以产生有效的抗肿瘤治疗作用[4-6]。

　　细胞膜表达有功能的Fas蛋白,并且其表达量达到一定强度是通过Fas/FasL途径诱导凋亡作用的首要条件[6]。对于不表达或弱表达Fas分子的细胞,其基因在分子调节中也存在转录活化或去抑制的潜能。通过某些细胞因子可以上调Fas的表达水平[7,8],进行基因的转染来提高Fas表达水平也是有效的方法。我们用脂质体介导的基因转染方法成功地将Fas表达质粒pCMV-Fas转入到了肺癌细胞系A-549，筛选出阳性克隆，并进行了鉴定。直接免疫法流式细胞术证明转染后的A-549细胞系Fas分子表达明显增加。

　　人类恶性肿瘤细胞系对Fas抗体或配体触发凋亡信号的敏感性主要依赖于细胞表面Fas的表达水平[5]。我们将低表达Fas的肺癌细胞转Fas基因后显著地增加了表达,再用Fas抗体诱导细胞凋亡,导致了A-549细胞凋亡数明显增多;而未转Fas基因的A-549细胞由于Fas表达较低,细胞凋亡数也较少,实验结果证实了Fas分子的表达水平在诱导细胞凋亡中的重要作用,同时也证明了Fas系统依赖性凋亡的细胞内信号途径是可以以某种方式活化的,与文献报道的结论一致[1，10]。因而,深入研究细胞表面Fas表达的调控因素十分必要。

　　Fas缺陷的小鼠不表达或表达突变的Fas分子而不能起到细胞内信号作用。相当多的肿瘤细胞存在着Fas分子的结构性低表达或丧失表达[9]，可能促使肿瘤细胞逃逸了机体正常的免疫清除机制,使肿瘤发生或进展。寻找出这些细胞表面Fas分子表达的调节因素,对有效地治疗体内恶性肿瘤是至关重要的。本研究结果证实了Fas诱导肺癌细胞凋亡通路的实现：转Fas基因后加用抗Fas抗体，A-549/Fas细胞中凋亡的效应分子caspase-3的底物PARP分解产物含量明显升高。可以判定Fas/FasL的结合产生的凋亡信号由膜外传至膜内，又由胞浆中参与信号传导的物质中介，到达caspase家族，此家族的激活最终导致不可逆的凋亡。