GHGKHKNK八肽对肿瘤细胞克隆形成、黏附及体外侵袭能力的影响

　　作者：吕刚 杜培革 田丹 安丽萍 张成义 申野 孙靖辉 李坦 张秀娟 高莉囡 杨松 万晓燕 李坦诚 作者单位：(北华大学生命科学研究中心，吉林 吉林 132013)

　　【摘要】 目的 探讨GHGKHKNK八肽对小鼠黑色素瘤B16F10细胞克隆形成与体外侵袭能力的作用及其机制。方法 用不同实验方法观察GHGKHKNK八肽对克隆形成能力、细胞侵袭能力及GHGKHKNK八肽对层黏连蛋白受体(LNR)，细胞黏附分子1(ICAM1)，内皮组织钙黏连素(Ecadherin)在小鼠黑色素瘤B16F10细胞中表达情况。结果 不同剂量GHGKHKNK八肽对小鼠黑色素瘤细胞B16F10的克隆形成侵袭均有抑制作用，与对照组相比较均有显著性差异;小鼠黑色素瘤细胞B16F10经免疫细胞化学染色后，可见小鼠黑色素瘤细胞B16F10LNR、ICAM1、Ecadhesin表达降低。结论 GHGKHKNK八肽可以明显抑制肿瘤细胞的克隆形成、黏附和侵袭能力。

　　【关键词】 GHGKHKNK;肿瘤细胞;肿瘤侵袭

　　The effect of GHGKHKNK octapeptide on clone formation, adhesion and in vitro invasion of carcinoma

　　Lü Gang, DU PeiGe, TIAN Dan, et al.

　　Life Scientific Research Center of Beihua University, Jilin 132013, Jilin, China

　　【Abstract】 Objective To explore the effect of GHGKHKNK octapeptide on the clone formation and in vitro invasion of melanoma B16F10 cell strain. Methods The clone formation rate was tested to investigate the influence of octapeptide on clone formation of melanoma B16F10 cell strain. Immunochemistry SP method was used to detect the effect of the octapetide on the expression level of LNR，ICAM1 and Ecodherin in melanoma B16F10 cell strain. Results Different dosages of GHGKHKNK octapeptide significantly inhibited clone formation and invasion of melanoma B16F10 cell strain compared with the control group; Immunocytochemical staining of melanoma B16F10 cell strain showed the decreased expression levels of LNR, ICAM1 and Ecadhesion. Conclusions GHGKHKNK octapeptide inhibits the clone formation, adhesion and invasion of melanoma B16F10 cell strain.

　　【Key words】 GHGKHKNK; Melanoma; Invasion

　　肿瘤细胞的侵袭、转移是一个多步骤发生的、多环节的过程，在癌症治疗过程中，控制肿瘤侵袭和转移是关键〔1，2〕。细胞黏附分子表达异常或功能丧失在肿瘤转移过程中起着非常重要的作用。恶性黑色素瘤具有高度转移的特性，其治疗目前主要有手术、化学治疗和放射线治疗三种，都存在一定的弊端，目前抗癌药物的治疗基本上是以杀死或抑制肿瘤细胞来发挥药效学作用的，尚没有即能够抑制肿瘤细胞又能抑制其转移的药物。随着研究的深入人们发现许多小肽在抗肿瘤侵袭转移方面有一定的作用〔3〕。本实验利用多肽合成仪合成含有HisGlyLys模序的GHGKHKNK八肽。通过观察平板克隆形成实验、细胞侵袭实验、免疫组化SP法研究GHGKHKNK八肽在体外对恶性黑色素肿瘤B16F10细胞系的克隆形成、黏附和侵袭能力，旨在探讨GHGKHKNK八肽的抗肿瘤转移能力。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 小鼠黑色素瘤高转移细胞株B16F10由吉林大学馈赠。RPMI1640培养基、胎牛血清，细胞为单层贴壁细胞, 培养条件为37℃、5%CO2孵箱孵育,用含10% 胎牛血清(FBS) 的RPMI1640培养液培养。细胞在培养过程中均无支原体、细菌以及其他鼠源病毒的感染;GHGKHKNK八肽由北京博奥森生物技术有限公司合成纯度98%以上。胰酶 Singma公司，美国GIBCO公司,基质胶Matrigel以及细胞侵袭实验试剂盒购于美国BD生物科技公司，免疫细胞化学SP试剂盒(LNR、ICAM1、Ecadherin)购于福州迈新生物工程公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力 将对数生长期的三组细胞分别以2.5 g/L胰蛋白酶消化成单个细胞悬液, 并作梯度倍比稀释, 按每孔50个细胞接种于24孔板, 每组细胞各接种6孔。静止培养2-3 w, 当培养板出现肉眼可见的克隆时终止培养。PBS清洗后加纯甲醇1 ml固定15 min, 吉姆萨液染色。将培养板置于显微镜低倍数下计数大于50个细胞的克隆数, 按公式计算克隆形成率。克隆形成率(%)=克隆数/接种数×100%。

　　1.2.2 细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力 将浓度为0.5 g/L Matrigel人工基质胶20 μl铺于Transwell侵袭小室聚碳酯微孔膜(孔径8 μm)的上表面, 置37℃ 30 min使其聚成凝胶。Transwell上室中分别加入已消化重悬的各组细胞100 μl (1×108/L),下室中加入600 μl含趋化因子无血清RPMI1640培养基, 培养24 h后取出,PBS清洗,棉签去除滤膜上层细胞, 将已经侵入并贴附于微孔膜下层的细胞固定并吉姆萨液染色, 显微镜下直接观察穿过膜的细胞数。随机计数5个视野, 计数每个视野内穿过8 μm微孔的细胞数。以侵袭细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力。

　　1.2.3 采用免疫组化法检测LNR、ICAM1、Ecadherin的表达 将处于对数生长期的小鼠黑色素瘤细胞B16F10肿瘤细胞消化成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×105,将准备好的玻片放置24孔培养板中,将细胞悬液滴至小玻片中,待细胞生长密度达到75%饱和度时,弃去培养基每孔加入含有不同药物浓度的无血清RPMI1640培养基0.9 ml，对照组加入加1 ml无血清RPMI1640培养基，37℃、5%CO2孵箱孵育48 h，然后PBS清洗3次，用甲醇固定10 min，完毕再用PBS洗片1次晾干后，用中性树胶固定在载玻片上，3%过氧化氢孵育8 min，PBS清洗3次，滴加正常山羊血清工作液，室温孵育15 min弃去，分别滴加LNR、ICAM1、Ecadherin抗体工作液，37℃放置1 h，PBS清洗3次，DAB显色后水洗，Mayer苏木精复染，然后在显微镜下随机取五个视野分别记录100个细胞，记录阳性细胞数。

　　1.3 统计学处理 所有数据应用SPSS10.0 统计软件对实验结果进行单因素方差分析。

　　2 结果

　　2.1 GHGKHKNK八肽对细胞克隆形成能力的影响 不同剂量GHGKHKNK八肽对小鼠黑色素瘤细胞B16F10的克隆形成均有抑制作用，与对照组相比较均有显著性差异(P<0.05);其中GHGKHKNK八肽10-4mol/L剂量肿瘤细胞抑制率达56.81%(见表1)。

　　2.2 GHGKHKNK八肽对细胞侵袭能力的影响 10-4 mol/L和10-5 mol/L GHGKHKNK八肽化合物在体外作用48 h后可以显著抑制小鼠黑色素瘤细胞B16F10细胞的侵袭，穿膜细胞数与对照组比较具有显著性差异(P<0.05)(见表2)。

　　2.3 GHGKHKNK八肽对LNR、ICAM1、Ecadherin表达情况的影响 黑色素瘤细胞经免疫细胞化学染色后，细胞浆和细胞膜呈棕黄色为LNR、ICAM1、Ecadherin表达阳性，给药组瘤细胞染色程度较对照组变浅，即黑色素瘤细胞LNR、ICAM1、Ecadherin表达降低。GHGKHKNK八肽可下调LNR、ICAM1、Ecadherin在B16细胞的表达，GHGKHKNK八肽10-4mol/L、 10-5mol/L和10-6mol/L阳性细胞数明显减少，具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

　　表1 GHGKHKNK八肽对小鼠黑色素瘤细胞B16F10克隆形成的抑制作用(略)

　　与对照组比较：1)P<0.05，下表同

　　表2 GHGKHKNK八肽小鼠黑色素瘤细胞B16F10肿瘤细胞的侵袭抑制作用(略)

　　表3 GHGKHKNK八肽对小鼠黑色素瘤细胞B16细胞LNR、ICAM1、Ecadherin表达情况的影响(略)

　　3 讨论

　　肿瘤转移是一个相当复杂的过程，肿瘤细胞的侵袭和转移涉及到黏附、运动、降解细胞外基质或基膜等许多环节，肿瘤细胞对基质胶的侵袭能力反映了细胞黏附和运动能力这两个肿瘤细胞扩散的重要特征，阻断其中之一即可有效地抑制其侵袭的过程。

　　近年来, 随着研究的深入, 多肽对肿瘤生长和转移的抑制作用逐渐引起人们的重视〔3〕。1990年Alino 等〔4〕发现5 肽YIGSR(酪氨酸异亮氨酸甘氨酸丝氨酸精氨酸) 可使肺癌转移能力下降。最近，研究发现人的高分子激肽原第5结构域中富含组氨酸的区域能够选择性的抑制人脐静脉和毛细血管上扦细胞的增殖并抑制小鼠角膜新血管的形成〔5〕，也能够作为一个抗黏附蛋白与尿黏连蛋白(LN)竞争,与尿激酶受体结合，进而抑制上皮细胞的侵袭与黏附〔6，7〕。因此，我们从人的高分子激肽原第5结构域中选择了含有能在体外抑制细胞黏附和浸润的关键模序HisGlyLys的GHGKHKNK八肽化合物，我们通过观察GHGKHKNK八肽对体外克隆形成能力、侵袭能力以及细胞表面黏附因子的表达的影响来间接反映其抗肿瘤作用，尤其是对肿瘤细胞侵袭和转移的影响。

　　B16F10黑色素瘤最初是自发在Jackson 实验室C57BL/6J 小鼠的耳部皮肤, 后来逐渐筛选出强转移性的B16亚型细胞系。小鼠黑色素瘤细胞B16F10是高转移的黑色素瘤细胞系〔8〕,在体外培养以黏附型方式生长, 多呈梭形、不规则三角形恶性增殖。10-4mol/L GHGKHKNK八肽剂量与肿瘤细胞在体外作用24 h 和48 h 后可以抑制B16F10 细胞的生长,抑制率达57.20% 。Matrigel 胶是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分,含有层黏连蛋白、Ⅳ型胶原等, 它能在培养基中重组形成与天然基底膜极为相似的膜结构, 可用于研究肿瘤细胞的黏附能力〔9〕。不同浓度GHGKHKNK八肽可明显降低B16F10细胞在Matrigel胶上的黏附, 提示GHGKHKNK八肽可使肿瘤细胞与继发灶细胞外基质的黏附能力降低, 降低肿瘤细胞的转移潜力。小鼠黑色素瘤细胞B16F10细胞在趋化剂诱导下能够穿过Transwell 小室底部涂有Matrigel的聚碳酸酯膜,计数穿膜细胞数即可反映细胞的侵袭能力。小鼠黑色素瘤细胞B16F10 经不同浓度的GHGKHKNK八肽刺激48h,加入Transwell小室中,结果显示GHGKHKNK八肽能明显抑制小鼠黑色素瘤细胞B16F10细胞的侵袭,提示GHGKHKNK八肽处理过的肿瘤细胞即便是脱离原发灶,其侵袭能力低, 同样不具有转移潜力。因此，我们的实验表明GHGKHKNK八肽在体外对小鼠黑色素瘤细胞B16F10 的增殖、黏附、侵袭均有抑制作用。

　　【参考文献】

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