ATP-生物荧光法体外药敏试验在结肠癌化疗中的临床应用

　　作者：郭洪斌 刘意 郭春芳 曹锦秋 孟庆斌 于洪涛 作者单位：吉林省人民医院肿瘤科，吉林 长春 130021 吉林省人民医院普外科 长春市生物制品研究所

　　【摘要】 目的 研究三磷酸腺苷生物荧光(ATP-TCA)法体外药敏试验与结肠癌化疗疗效的相关性。方法 取结肠癌术后新鲜组织标本22例，应用ATP-TCA法对5-氟脲嘧啶(5-FU)、草酸铂(L-OHP)和L-OHP+5-FU体外药敏试验;根据药敏试验将患者分为有效组和无效组，并应用L-OHP+5-FU/CF方案进行化疗。结果 ATP-TCA试验可评价率95.5%，5-FU、L-OHP和LOHP+5-FU的敏感率分别是33.3%、19.1%和42.9%;化疗有效率有效组77.8%、无效组8.3%。结论 ATP-TCA法体外药敏试验对结肠癌患者化疗药物及化疗方案筛选，实现化疗个体化有重要的价值。

　　【关键词】 三磷酸腺苷荧光测定法;化疗药;结肠癌

　　如何实施化疗方案个体化、提高化疗用药的科学性和疗效是肿瘤临床工作者急需解决任务之一。本文应用三磷酸腺苷生物荧光(ATP-TCA)法体外检测了22例结肠癌术后组织标本对化疗药物的敏感性，并观察了患者化疗的近期疗效。

　　1 材料与方法

　　1.1 对象 肿瘤组织标本来源于我院2005～2006年住院的22例晚期结肠癌患者术后新鲜组织标本。男15例，女7例，年龄60～74岁(中位年龄64.2岁);患者均经电子结肠镜和病理诊断并行手术治疗，术后患者恢复良好，Karnofsky评分≥70分，预计生存期≥3个月;无肠梗阻;白细胞>4.0×109/L，血小板>100×109/L;无心、肝、肾严重功能障碍;病人有远处脏器转移病灶可供客观测量。

　　1.2 主要仪器和试剂 MPL-1型荧光测定仪(德国Berthold公司)。ATP-TCA肿瘤药敏检测试剂盒(北京金紫晶生物技术有限公司)，培养基，组织消化酶，红细胞去除液，ATP提取液，荧光酶-荧光素冻干品。L-OHP(江苏恒瑞医药股份有限公司)，5-FU(天津金耀氨基酸有限公司)。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 癌细胞悬液制备 新鲜结肠癌组织标本用无菌生理盐水冲洗，在含抗生素的培养基中浸泡20 min，无菌条件下，剥离肿瘤组织的纤维、脂肪组织，将标本剪成约0.5～1.0 cm3大小的碎块。置于50 ml离心管中，加入10 ml含0.2% Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶的培养基，于5%CO2孵育箱、37℃、95%湿度孵育1.5～3 h，每隔15～30 min振荡一次，消化完全后，用160目筛网滤过，然后加入25 ml培养基，混匀，400 g离心10 min，弃上清，重复一次。若红细胞含量大于25%，需加入10 ml预冷的红细胞裂解液破裂红细胞，混匀，离心。取35 μl用台盼蓝染色，记数活的肿瘤细胞。

　　1.3.2 体外药敏实验 取细胞悬液，调整细胞至20～40万个/ml浓度，以每孔0.1 ml接种至96孔培养板内。按200%、100%、50%、25%、和12.5%的血浆峰值浓度，将药物加入培养孔中，每个浓度3个平行孔和对照孔，于5%CO2、37℃、95%湿度下孵育5 d。加入肿瘤细胞ATP提取液0.1 ml，混匀后室温下孵育5 min，取0.05 ml混合液置荧光测定仪上测定各孔在560 nm波长处的荧光强度。用荧光测定仪自带分析软件计算各测试浓度抑制率及各种药物IC50和IC90 。

　　1.3.3 患者分组和治疗方法 根据体外药敏实验对L-OHP+5-FU的敏感性，将患者分为体外有效组和体外无效组。患者于术后20～30 d开始化疗;具体方案：L-OHP 85 mg/m2静脉滴注，第1天2 h;CF 200 mg/m2静脉滴注，第1天2 h;5-FU 2 000 mg/m2持续静点48 h，21 d为1周期，化疗4周期后进行临床疗效评估。

　　1.4 结果评估 肿瘤药物敏感性的评估〔1〕，敏感度分级定义：高度敏感(SS，+++)：IC90<100%TDC(药物浓度)和IC50<25%TDC;部分敏感(IS，++)：IC90>100%TDC和IC50<25%TDC;低度敏感(MS，+)：IC90<100%TDC和IC50>25%TDC;耐药(R,-):IC90>100%TDC和IC50>25%TDC。体外有效= SS+IS;体外无效= MS+R。

　　临床疗效按照WHO评价标准分为：完全缓解(CR)，部分缓解(PR)，无变化(NC)，进展(PD)，有效(CR+PR，RR)。

　　2 结果

　　2.1 化疗药物对结肠癌的体外敏感率 22例标本中1例因为细菌污染而放弃，实验的可评价率为95.5%〔2〕。不同个体对同一种化疗药物的敏感性也不同(表1);21例结肠癌细胞体外对5-FU、L-OHP、L-OHP+5-FU敏感性不同(表2)。

　　表1 结肠癌细胞对化疗药物体外敏感谱及患者化疗近期疗效对照(略)

　　表2 化疗药物对结肠癌细胞体外敏感率比较(略)

　　2.2 剂量-效应关系 癌细胞与化疗药物孵化，药物浓度与癌细胞生长抑制率的剂量-效应曲线如图1，反映出不同药物及同种药物不同浓度，对癌细胞杀伤作用及单药与联合用药作用的差异。

　　图1 患者4的药物浓度与癌细胞生长抑制率的剂量-效应曲线(略)

　　对L-OHP+5-FU有效组9例(男6、女3 )，年龄61～71(中位年龄63.5)岁;无效组12例(男8、女4)，年龄60～73(中位年龄64.9)岁;化疗疗效见表3。

　　表3 体外试验有效组与无效组患者化疗近期疗效比较(略)

　　3 讨论

　　结肠癌细胞体外对5-FU、L-OHP和L-OHP+5-FU的敏感率分别为33.3%、19.1%和42.9%，5-FU好于L-OHP，联合用药好于单药。临床应用L-OHP+5-FU/CF方案治疗，有效组的有效率77.8%，无效组为8.3%，两组均无CR，总有效率为38.1%与报道相符〔3，4〕。临床化疗有效率低于体外药敏试验的敏感率，是因为恶性肿瘤对化疗药物的敏感性原因复杂，不但与肿瘤细胞耐药基因有关，在机体内还涉及到体内药物代谢酶及其分布和在肿瘤细胞的表达等多种原因，而且这种分布和表达存在着显著的个体差异〔5，6〕。

　　ATP-TCA法是一种测定胞内ATP含量的技术;当细胞死亡后，细胞内ATP被迅速水解，测得的ATP含量可以反映出存活细胞量;其剂量和抑制曲线的趋势变化线性分布广，肿瘤生长抑制率分析介于10%～15%的变异系数，显示该方法的重复性强〔7〕。体外药敏实验结果与临床疗效比较，总符合率为90.4%，阳性符合率77.8%，阴性符合率为91.7%，与文献报道基本相符〔8〕。因此，ATP-TCA体外药敏试验用来作为结肠癌患者化疗药物及化疗方案筛选，对实现化疗个体化有重要的价值。

　　【参考文献】

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　　3 陆建伟,潘良熹,黄富麟,等.高剂量亚叶酸钙、氟脲嘧啶与草酸铂治疗晚期难治性结直肠癌〔J〕.中国癌症杂志，2002;12(3):242-4.

　　4 郑亚兵,裘友好,马胜林.奥沙利铂加5-FU/CF联合顺铂腹腔温热灌注治疗晚期大肠癌的临床观察〔J〕.实用肿瘤杂志,2003;18(4)：327-8.

　　5 Yu LJ，Matias J，Scudiero DA,et al.P450 enzyme expression patterns in the NCI human tumor cell line panel〔J〕.Drug Metab Dispos，2001;29(3):304-12.

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　　7 Andreotti PE，Cree IA，Kurbaeher CM,et al.Chemosensitivity testing of human tumors using a microplate adenosine triphosphate luminescence assay：clinieal correlation for cisplatin resistance of ovarian carcinoma〔J〕.Cancer Res,1995;55(22)：5276-82.

　　8 赖启明,金宝翠,刘立华.ATP生物发光测定白血病细胞体外药物敏感试验〔J〕.南京铁道医学院学报,1996;15(2):74-5.