As2O3对兔Vx2软组织肿瘤VEGF表达和肿瘤细胞凋亡的影响

　　作者：张鹏国 周庆伟 袁庆海 郑维民 张宇晨 宫心扣 韩冰 黄革 杨海山 作者单位：吉林大学第二医院放射线科，吉林 长春 130041

　　【摘要】 目的 探讨不同剂量As2O3对Vx2软组织肿瘤细胞凋亡及血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的影响及As2O3抗肿瘤的作用机制。方法 32只大白兔皮下软组织内肿瘤种植2 w后,随机分为实验组和对照组。实验组根据As2O3用药量不同分为1、2、4 mg·kg-1·d-1 3个亚组，每组8只，对照组注射生理盐水，连续给药7 d，停药后继续观察3 w后处死大白兔，采用MRI测量治疗前后肿瘤最大直径，分别于给药前及处死前行肝肾功能检查，检测As2O3对肝肾毒性作用;采用原位末端标记法(TUNEL法)检测肿瘤细胞的凋亡指数及VEGF染色法观测As2O3抑制肿瘤细胞VEGF表达的程度。结果 MRI显示对照组肿瘤随观察时间延长呈持续增大;实验组随着用药剂量增加，肿瘤增长缓慢(与对照组相比P<0.05);1、2 mg·kg-1·d-1亚组与4 mg·kg-1·d-1亚组组间差异较明显(P<0.05)，1 mg·kg-1·d-1与2 mg·kg-1·d-1亚组组间差异不明显(P>0.05)。给药前及处死前行耳缘静脉取血,测定ALT、AST、BUN、Cr水平，给药前各组间差异不明显(P>0.05)，处死前基本恢复正常，组间差异不显著(P>0.05)。HE染色显示对照组肿瘤周围组织浸润明显，实验组周围组织浸润不明显;TUNEL法对照组肿瘤坏死周围细胞凋亡与治疗组比较差异显著(P<0.05)，1、2 mg·kg-1·d-1与4 mg·kg-1·d-1亚组组间差异较明显(P<0.05)，1 mg·kg-1·d-1与2 mg·kg-1·d-1亚组组间差异不明显(P>0.05)。VEGF染色法显示肿瘤细胞内VEGF表达随药物浓度增加而减少，与对照组相比差异显著(P<0.05)。结论 经腹腔注射As2O3能够控制Vx2软组织肿瘤增长，同时诱导肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤血管生成，并与剂量相关，其对肝肾功能毒性作用不明显。

　　【关键词】 软组织肿瘤;家兔;凋亡;血管内皮生长因子

　　基金项目：吉林省科技厅资助项目(200705241)

　　As2O3自从在临床上应用于治疗血液性肿瘤以来，人们对其治疗实体肿瘤的价值及作用机制进行了初步探讨。体内外实验表明As2O3具有诱导肿瘤凋亡,多途径抑制肿瘤增殖转移,毒副作用小和抗癌谱广的特点。As2O3抗实体肿瘤的给药途径、剂量、毒性、疗效及其作用机制仍有待于进一步的探讨。采用经腹腔给药途径探讨不同剂量As2O3对Vx2软组织肿瘤疗效、相关机制及肝肾毒性的研究未见文献报道，本研究旨在为As2O3治疗实体瘤提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料与仪器 德国西门子公司生产的1.5T ESPREE 磁共振机器;原位细胞凋亡检测试剂盒(武汉博士得生物工程有限公司);S-P超敏试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司); As2O3由白求恩医学部公共卫生毒理系李志超教授提供;实验动物为新西兰大白兔32只,体重2.1～3.2 kg,雌雄不分,学校动物实验中心提供;Vx2活体瘤株,唐都医院介入科张洪新教授惠赠。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 动物模型建立 将传种的种兔处死后立即无菌条件下剥离肿瘤,选取鱼肉状组织用眼科剪剪碎,用生理盐水反复吹打，200目细胞筛过滤制成Vx2瘤细胞悬液，台盼蓝染色计活细胞数，配成1×108个细胞/ml浓度的Vx2瘤细胞悬液。直视下用1 ml注射器吸取0.5 ml Vx2瘤细胞悬液向新西兰实验兔大腿外侧皮下直接注射。

　　1.2.2 实验分组及给药方法 肿瘤模型建成后2 w将32只兔随机分为实验组(24只)和对照组(8只),实验组根据As2O3用药量不同分为每天1、2及4 mg/kg 3个亚组，每组8只。采用腹腔内给药，对照组注射生理盐水，连续7 d。

　　1.3 观察指标

　　1.3.1 肝肾功能影响 分别于给药前及处死前行耳缘静脉取血,测定ALT、AST、BUN、Cr水平，并行肝脏及肾脏病理学检查。

　　1.3.2 肿瘤生长情况 采用MRI观察治疗前后肿瘤最大直径改变，用于疗效评价。

　　1.3.3 肿瘤组织病理学观察 光镜下观察：兔处死后取肿瘤外带非坏死区肿瘤块，10%的福尔马林固定,石蜡包埋切片,行组织病理切片，用于形态学检查，常规HE染色。S-P超敏试剂盒检测肿瘤细胞的血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达,一抗为兔抗VEGF多克隆抗体，VEGF阳性表达表现为细胞胞浆棕黄色染色，其结果判断采用免疫组织化学评分(IHS)方法,结合阳性细胞百分比及阳性细胞染色强度两方面评分：a 为阳性细胞百分比(无阳性细胞为0分，阳性细胞占1%～10%为1分，11%～50%为2分，51%～100%为3分)，b为阳性细胞染色强度(阴性0分、弱阳性1分、中度阳性2分、强阳性3分);a、b两相相乘之积即为该切片的IHS评分。采用缺口末端标记法(TUNEL法)检测肿瘤组织中的凋亡细胞。凋亡细胞的判断标准:散在分布,胞核或胞核和胞质同时呈棕黄色,有典型凋亡形态特征,包括与周围细胞分离、胞体变小、染色体浓缩、核碎裂或染色质沿核膜呈规则半月形边集或凋亡小体形成。高倍镜下在肿瘤组织随机选择5个视野计数1 000个肿瘤细胞,其中凋亡细胞所占百分比即为凋亡指数(AI)。

　　1.4 统计学处理 统计学分析使用SPSS10.0软件，各组之间计量资料比较采用方差分析。采用Cochran-Mantel-Haenszel Statistics比较实验组及对照组IHS评分。

　　2 结果

　　2.1 As2O3对肝肾功能影响 见表1。给药前各组间ALT、AST、BUN、Cr差异不明显(P>0.05)，处死前基本恢复正常，组间差异不显著(P>0.05)。4 mg/kg亚组实验兔肝脏光镜学检查未见异常表现。

　　2.2 两组肿瘤最大直径比较 MRI显示治疗前各组之间肿瘤最大径差异不显著(P>0.05);治疗后对照组肿瘤明显增大;实验组随着用药剂量增加，肿瘤增长缓慢，与对照组相比差异明显(P<0.05);1、2 mg/kg亚组与4 mg/kg亚组组间差异较明显(P<0.05)，1 mg/kg亚组与2 mg/kg亚组组间差异不明显(P>0.05)，见表2。

　　表1 治疗前及处死前各组ALT、AST、BUN、Cr水平(略)

　　表2 治疗前后各组肿瘤最大直径及各组AI值(略)

　　与对照组相比：1)P<0.05;与4 mg/kg亚组比较：2)P<0.05

　　2.3 两组AI值比较 HE染色显示对照组肿瘤周围组织浸润明显，实验组随着用药剂量增加周围组织浸润不明显;TUNEL法计数显示对照组坏死周围肿瘤凋亡不明显，实验组随着用药剂量增加，坏死周围肿瘤出现凋亡(与对照组相比P<0.05);1、2 mg/kg亚组与4 mg/kg亚组组间差异较明显(P<0.05)，1 mg/kg亚组与2 mg/kg亚组组间差异不明显(P>0.05)，见表2。

　　2.4 两组IHS评分比较 对照组IHS评分3分者2例，4分1例，6分5例;1 mg/kg亚组3分者4例，4分1例，6分3例;2 mg/kg亚组1分者1例，2分4例，3分1例，4分2例，4 mg/kg亚组0分者2例，1分3例，2分1例，3分2例。结果表明，对照组肿瘤IHS评分高，实验组随着用药剂量增加肿瘤IHS评分降低，与对照组相比差异明显(P<0.05);1、2 mg/kg亚组与4 mg/kg亚组组间差异较明显(P<0.05)。

　　3 讨论

　　3.1 细胞凋亡在肿瘤治疗中的作用已受到极大的重视 细胞不能凋亡是人类许多疾病包括癌症发生的基础。在肿瘤化疗中，选择以凋亡方式杀伤肿瘤细胞,为提高肿瘤化疗疗效,减少副作用开辟了新途径。有些学者〔1〕甚至提出,将诱导肿瘤细胞的凋亡作为以后肿瘤治疗研究的主要目标与手段,因此,选择凋亡诱导率高的药物对实现这一目标极为重要。本文采用的砷剂(As2O3)是中药砒霜中的主要成分。As2O3作为治疗急性早幼粒细胞白血病的有效药物应用于临床以来，国内外学者对其抗肿瘤作用机制进行了深入研究，一般认为砷剂可以从不同方面作用于肿瘤,导致肿瘤细胞凋亡、分化,也可以抑制其增殖，存在数种不同的促凋亡途径〔2～6〕。本研究采用缺口末端标记法研究了不同浓度的As2O3 诱导Vx2软组织肿瘤细胞凋亡的作用。Vx2肿瘤是Shope病毒诱发的乳头状瘤恶变后经兔传代而取得的实验性肿瘤，近似人的实质器官原发肿瘤，具有可多部位种植及种植后成活率高，生物学性质稳定，生长迅速的特点〔7〕。本研究建立的Vx2皮下软组织肿瘤模型，成瘤率达100%，观察14 d时肿瘤生长迅速，且影像学测量肿瘤大小较一致，统计学分析各组间比较无明显差异，适合于作为软组织肿瘤的动物模型。研究结果表明，随着药物浓度的增加，Vx2软组织肿瘤细胞凋亡指数明显增加，具有浓度依赖的特点。

　　3.2 微血管生成在肿瘤的转移、浸润中具有重要的作用〔8〕，VEGF具有促进肿瘤新生血管生成的作用。As2O3可直接诱导血管内皮细胞和白血病细胞凋亡,使VEGF表达减少,抑制肿瘤的新生血管生成。Yong等〔4〕将As2O3作用于甲基胆蒽诱导的鼠纤维肉瘤,经同位素等检测发现As2O3可引起该肿瘤中心血流减少，选择性坏死，推测该现象可能与As2O3诱导血管内皮细胞损伤,引起肿瘤滋养血管选择性闭塞,以及肿瘤坏死因子介导等有关。本研究采用免疫组化方法，研究As2O3对肿瘤细胞VEGF表达的影响。研究结果表明，随着药物浓度的增加肿瘤IHS评分降低，表明肿瘤细胞内VEGF表达减少，间接提示As2O3能够抑制肿瘤血管生成，光镜检查证实治疗组对周围组织浸润较对照组减轻。

　　3.3 对肿瘤疗效的评价采用1998年欧洲癌症研究与治疗协会(EORTC)、美国国立癌症研究所(NCI)及加拿大国立癌症研究所(NCIC)提出的抗肿瘤药对实体肿瘤客观疗效评定新标准(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，RECIST)〔9，10〕，仅以肿瘤的最大长径评价肿瘤的变化。CT或MRI 是评价病灶变化大小最有用的并可重复随诊的方法。本研究采用MRI测量了肿瘤治疗前后最大长径的变化，结果显示治疗组随着药物浓度的增加，肿瘤长径的增长明显延缓，且随药物浓度增加，作用越明显，而对照组肿瘤长径增长明显大于治疗组。

　　3.4 As2O3对肝脏和肾脏的毒性作用一直为临床所关注，本研究于治疗前及处死前经兔耳缘静脉采血，行ALT、AST、BUN、Cr检查，借以检测As2O3对肝脏和肾脏毒性，结果显示As2O3对治疗组肝肾功能的影响与对照组相比未见明显差异，且组间差异不显著。因此在安全有效的治疗剂量范围内，As2O3的肝肾毒性作用不明显,可以用于软组织肿瘤的治疗。

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