XPC基因多态性与食管鳞状细胞癌、贲门腺癌的发病风险

　　作者：郭炜，周荣秒，李琰，王娜，万玲玲 作者单位：050011 石家庄，河北医科大学第四医院、河北省肿瘤研究所分子生物学研究室

　　【摘要】 目的 探讨DNA修复基因XPC第9内含子PAT+/-和第15外显子A2920C 单核苷酸多态性(SNP)与河北省食管癌、贲门癌高发区磁县和涉县人群食管鳞状细胞癌(ESCC)和贲门腺癌(GCA)遗传易感性的关系。方法 采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)分析方法检测327名ESCC患者、253名GCA患者和612名健康对照个体的XPC基因第9内含子PAT+/-及第15外显子A2920C SNP的基因型，比较各组间等位基因及基因型频率的分布。结果 XPC基因第9内含子PAT+/-和第15外显子A2920C的基因型及等位基因型频率在ESCC患者组、GCA患者组和对照组之间，其总体分布均无显著性差异(P>0.05)。根据吸烟状况和上消化道肿瘤家族史分层分析发现，与A/A基因型比较，携带C/C基因型可能增加非吸烟个体ESCC的发病风险 (经性别、年龄和上消化道肿瘤家族史校正后的OR=2.09，95%CI=1.14～3.81)。结论 XPC基因第15外显子C/C基因型可能是影响河北省食管癌、贲门癌高发区磁县和涉县非吸烟人群ESCC发病风险的因素之一。

　　【关键词】 食管鳞状细胞癌;贲门腺癌;XPC;基因多态性;肿瘤易感性

　　Correlation of XPC Polymorphisms to the Risk of Esophageal Squamous Cell Carcinoma and Gastric Cardiac Adenocarcinoma

　　GUO Wei，ZHOU Rongmiao，LI Yan，WANG Na，WAN Lingling

　　Laboratory of Molecular Biology, The Fourth Hospital Affiliated to Hebei Medical University, Hebei Cancer Institute, Shijiazhuang 050011, China

　　Abstract：Objective To investigate the correlation of XPC intron 9 PAT+/- and exon 15 A2920C SNPs with susceptibility to esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and gastric cardiac adenocarcinoma (GCA) in a population of high incidence region of Hebei Province. Methods XPC intron 9 PAT+/- and exon 15 A2920C SNPs were genotyped by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCRRFLP) analysis in 327 ESCC patients, 253 GCA patients and 612 healthy controls. Results The overall genotype and allelotype distributions of XPC intron 9 PAT+/- and exon 15 A2920C in ESCC and GCA patients were not significantly different from that in healthy controls(P>0.05). When stratified for smoking status and UGIC family history, compared with A/A genotype, C/C genotype significantly increased the risk of developing ESCC in nonsmoker group [age and gender and UGIC family history adjusted odds ratio (OR)=2.09, 95%CI=1.14～3.81]. Conclusion C/C genotype of XPC exon 15 may be one of the factors that affect the risk of developing ESCC in nonsmoking population in the high incidence region of Hebei Province.

　　Key words：Esophageal squamous cell carcinoma;Gastric cardiac adenocarcinoma;XPC;Polymorphism; Susceptibility

　　0 引言

　　XPC基因定位于染色体3p25，包括16个外显子和15个内含子，编码一个含940个氨基酸的蛋白质，其第9内含子和第15外显子均存在单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)[1]。XPC蛋白是着色性干皮病基因C的产物，对于维持基因组的稳定和完整性相当重要，其功能异常可导致DNA修复能力下降，因此与疾病易感性有关[24]。

　　XPC第9内含子PAT+/-SNP、第15外显子A2920C SNP与头颈部、肺等多个部位肿瘤的发病风险关系已有报道[512]，但是，XPC基因多态性与食管癌、贲门癌发病风险的关联研究尚未见报道。本研究应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(Polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism, PCRRFLP)分析方法，探讨河北省食管癌、贲门癌高发区磁县和涉县人群XPC基因第9内含子PAT+/-及第15外显子A2920C SNP对食管鳞状细胞癌、贲门腺癌易感性的影响。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象

　　327名食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)患者、253名贲门腺癌(Gastric cardiac adenocarcinoma, GCA)患者均来自河北省食管癌、贲门癌高发区磁县和涉县的癌前普查，612名健康对照为在相同地区同一时间通过癌前普查获得，所有研究对象均知情同意本项研究，由专门的登记员调查所有研究对象的性别、年龄、吸烟史及上消化道肿瘤家族史。现吸烟或曾吸烟每天5支以上并持续2年或2年以上者定义为吸烟个体。家族中有1名以上一级亲属和(或)2名以上二级亲属患有食管癌、贲门癌、胃癌者定义为上消化道肿瘤(Upper gastrointestinal cancer, UGIC)家族史阳性。

　　1.2 标本采集及外周血白细胞DNA的提取

　　所有研究个体均采集静脉血5ml，经枸橼酸钠抗凝，4℃冰箱保存。采血后一周内，以蛋白酶K消化饱和氯化钠盐析法[13]提取外周血淋巴细胞染色体DNA。

　　1.3 XPC SNP基因分型

　　XPC基因第9内含子基因型检测应用PCR方法进行。上游引物为5′TAGCACCCAGCAGTCAAAG3′，下游引物为5′TGTGAATGTGCTTAATGCTG3′。PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳，突变基因型PAT+/+为344bp，野生基因型PAT-/-为266bp，杂合子PAT+/-基因型为344bp和266bp，见图1。

　　XPC基因第15外显子基因型检测应用PCRRFLP方法进行。PCR反应上、下游引物分别为5′GGAGGTGGACTCTCTTCTGATG3′和下游引物5′TAGATCCCAGCAGATGACC3′。PCR产物经限制性内切酶PvuⅡ(Takara)于37℃酶切16h后，进行2%琼脂糖凝胶电泳。突变基因型C/C存在PvuⅡ的识别位点产生582bp和183bp两条DNA片段，而野生基因型A/A缺乏PvuⅡ的识别位点保持原有PCR后的765bp的片段，杂合子A/C基因型则表现为765bp、582bp和183bp三条片段，见图2。

　　为进行基因型检测的质量控制，每一批PCR反应均以灭菌蒸馏水替代模板DNA作为阴性对照，XPC第9内含子的扩增产物随机挑取各基因型1例进行测序，而XPC第15外显子随机挑取10%进行重复实验。

　　1.4 统计学方法

　　经卡方检验比较基因型频率的观察值与预期值，进行HardyWeinberg平衡分析。病例组和对照组的XPC基因型及等位基因型分布比较采用行×列表的卡方检验进行。应用非条件Logistic回归模型计算多因素(性别、年龄、吸烟、上消化道肿瘤家族史)校正相对风险度的比值比(Odds ratio，OR)及其95%可信区间CI。P<0.05为有统计学意义。分别应用EH软件和2LD软件进行单体型和连锁不平衡分析。统计分析采用SPSS11.5软件包进行。

　　2 结果

　　2.1 一般特征

　　ESCC患者组、GCA患者组与对照组之间的性别、年龄构成相似(P>0.05)。ESCC患者组、GCA患者组中吸烟个体比例与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。ESCC患者组、GCA患者组中UGIC家族史阳性个体比例分别为48.0%、47.8%，显著高于对照组34.2%，表明UGIC家族史可能增加ESCC和GCA的发病风险(经性别、年龄和吸烟状况校正后的OR=1.80和1.75，95%CI=1.36～2.38和1.29～2.36)，见表1。表1 食管癌、贲门癌和对照组人口学分布及XPC PAT+/-和A2920C等位基因型频率(略)

　　所有标本均成功进行了基因型分型，测序及所有重复分型结果均与原结果相符。经卡方检验，XPC第9内含子及第15外显子SNP基因型分布均符合HardyWeinberg平衡(P>0.05)。

　　2.2 XPC基因第9内含子PAT+/- SNP与ESCC、GCA发病风险的关系

　　XPC基因第9内含子PAT和PAT+的等位基因频率及PAT-/-、PAT+/-、PAT+/+基因型频率在ESCC、GCA及对照组之间无显著性差异(P>0.05)，见表1、2。按吸烟状况和上消化道肿瘤家族史进行分层分析，未发现XPC基因第9内含子PAT+/- SNP影响ESCC和GCA的发病风险，见表2。表2 XPC PAT+/- SNP 与ESCC、GCA发病风险的相关性分析(略)表3 XPC A2920C SNP 与ESCC、GCA 发病风险的相关性分析(略)

　　2.3 XPC基因第15外显子A2920C SNP与ESCC、GCA发病风险的关系

　　XPC基因第15外显子A和C等位基因频率及A/A、A/C、C/C基因型频率在ESCC、GCA患者组与对照组之间无显著性差异，见表1、3。按吸烟状况和上消化道肿瘤家族史进行分层分析发现，在非吸烟组中ESCC患者的C/C基因型频率(14.6%)明显高于对照组(8.7%)，与A/A基因型比较，携带C/C基因型可能增加非吸烟组ESCC的发病风险(经性别、年龄和上消化道肿瘤家族史校正后的OR=2.09，95%CI=1.14～3.81，见表3。

　　2.4 XPC基因第9内含子PAT+/-及第15外显子A2920C SNP单体型分布

　　应用EH软件和2LD软件对XPC基因第9内含子PAT+/-及第15外显子A2920C SNP位点进行的联合分析显示，XPC基因第9内含子PAT-等位基因和第15外显子A等位基因存在连锁不平衡现象(D′=0.967348)。XPC A/-、A/+、C/-、C/+四种单体型，在ESCC、GCA患者组与对照组之间分布无显著性差异(P>0.05)。与A/-单体型比较，A/+、C/-、C/+单体型均未显著增加ESCC、GCA的发病风险，见表4。表4 XPC PAT+/-和A2920C SNP单体型频率与ESCC、GCA发病风险(略)

　　3 讨论

　　内源性和(或)外源性的诱变因素可损伤细胞的DNA，如果损伤不能修复，可能导致程序性细胞死亡或无节制的细胞增殖和肿瘤的发生。不同类型的DNA损伤修复由不同的修复途径完成，核苷酸切除修复途径可修复嘧啶二聚体或其他光合物、化学加合物和交联，但个体间的DNA修复能力存在一定差异，其差异可能与DNA修复基因的单核苷酸多态性密切相关[5]。XPC基因是核苷酸切除修复系统的重要组成成分。

　　有研究报道XPC基因第9内含子PAT+/+基因型可增加头颈部鳞状细胞癌和皮肤黑色素瘤的发病风险[5，6];Nelson等[7]报道PAT+/+基因型减少了皮肤鳞状细胞癌的发病风险，与基底细胞癌的发病风险无关。关于XPC基因 PAT+/- SNP与肺癌发病风险的关系，结果则很不一致，Marin等[8]报道PAT+/+基因型增加了肺癌的发病风险;Lee等[9]报道PAT+/+基因型减少了小细胞肺癌的发病风险;中国人群则报道PAT+/-多态与肺癌发病风险无关[10]。我们的研究结果提示PAT+/-多态与ESCC、GCA发病风险无关。关于XPC基因第15外显子A/C多态与肿瘤发病风险关系的研究结果也不一致，Blankenburg等[6]报道C等位基因增加了皮肤黑色素瘤的发病风险;Sanyal等[11]报道C等位基因增加了膀胱癌的发病风险;Lee等[9]报道C/C基因型减少了小细胞肺癌的发病风险;Forsti等[12]报道C/C基因型与乳腺癌发病风险无关。诸多研究结果的分歧提示XPC基因多态性针对不同部位的肿瘤可能起不同的作用，而且研究人群种族的不同对研究结果也有一定的影响，进一步提示进行大样本基础人群病例对照研究的重要性。

　　体外研究表明，XPC基因第15外显子A、C等位基因修复能力无显著性差异[4]，但是，XPC基因第15外显子C与第9内含子PAT+及第11内含子A存在连锁不平衡，而第11内含子为A/A基因型的XPC蛋白遗漏第12外显子区的几率比C/C基因型的XPC蛋白大2.6倍[4]，XPC蛋白第12外显子区是HHR23B蛋白的结合部位[4]，故遗漏第12外显子区的XPC蛋白不能与HHR23B蛋白结合，则XPCHHR23B复合体不能形成，进而影响DNA损伤识别及损伤DNA的修复。因此，XPC基因第15外显子为C/C基因型的个体可能增加ESCC的发病风险。环境因素和遗传因素均影响个体肿瘤的发病风险，吸烟是引起食管癌、贲门癌的主要环境因素，我们的研究结果提示XPC第9内含子PAT+/+基因型、XPC第15外显子C/C基因型增加非吸烟组个体ESCC的发病风险，由于已排除吸烟因素的影响，考虑是否遗传因素在发病风险中发挥主要作用，但是，其生物学方面的确切机制尚需要进一步研究。

　　本研究结果还显示XPC基因第9内含子PAT-等位基因与第15外显子A等位基因存在连锁不平衡，可为我们以后疾病的基因诊断和基因治疗提供一些思路。因为此类研究多是回顾性研究，且研究人群存在地区、人种和样本量的差异，因此有待于扩大样本量并在同种族、同地域人群中进行长期随访研究，并进一步观察XPC基因多态性与环境因素及其他遗传因素的相互作用，对揭示XPC基因多态性与肿瘤的确切关系有重要意义。

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