抑癌基因fhit对肝癌细胞HuH7体内外生长的影响

　　作者：许荣华，郑武平，夏立平 作者单位：海南医学院附属医院肿瘤外科，海南 海口 570102

　　【摘要】目的：研究外源性人脆性组氨酸三联体(fhit)的高表达对人肝癌细胞HuH7体内外生长的影响。方法：构建一个包含人脆性组氨酸三联体基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/fhit，转染fhit阴性的人肝癌细胞HuH7， 逆转录聚合酶链反应(RTPCR)、Western印迹法分别检测目的基因不同水平的表达， 通过细胞生长试验、流式细胞仪分析技术检测细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡。通过裸鼠移植瘤实验，观察fhit基因对人肝癌细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用。结果:RTPCR、Western印迹法检测转染pcDNA3.1(+)/fhit后HuH7细胞的fhitmRNA(1.1 kb)、fhit蛋白(16.8 kDa)表达阳性， 转染后对HuH7细胞的生长有抑制作用， 早期细胞凋亡增加， 与对照组比较差异有统计学意义[(78.51±1.17)vs(47.25±0.61)、(51.25±1.21), P<0.05]。fhit 在体内能明显抑制移植瘤的生长，与HuH7和HuH7C比较HuH7fhit细胞形成的肿瘤出瘤时间较晚，生长慢，肿瘤体积和瘤重小，差异有统计学意义(P<0.05)，抑瘤率分别为85.17% and 87.14%。结论：fhit基因通过诱导肿瘤细胞发生凋亡并导致其发生G1期阻滞在肿瘤基因治疗方面发挥作用。

　　【关键词】 肝癌;基因治疗;脆性组氨酸三联体

　　Effect of fragile histidine triad gene transduction on proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells HuH7

　　XU Ronghua, ZHENG Wuping, XIA Liping

　　(Department of Oncosurgery, Affiliated Hospital of Hainan Medical University Haikou 570102, China)

　　View from specialist: It is creative, and of certain scientific and educational value.

　　[ABSTRACT] Objective: To evaluate the effect of human fragile histidine triad gene(fhit) on cell prolifiration and apoptosis of human hepatocellular carcinoma lines HuH7 in vitro, and to investigate the inhibitory effect of fhit on the proliferation of cell lines HuH7 in nude mice. Methods: Established a recombinant pcDNA3.1(+)/fhit including functional region of human fhit, HuH7fhit, to transfer into the cells of human hepatocellular carcinoma in vitro. The mRNA and protein expression of the gene in the transfected cells was detected by RTPCR, western blot, respectively. MTT assay was used to assess the effect of fhit on proliferation. The change of cell cycle and apoptosis was measured by flow cytometry. 5 mice received subcutaneous transplantation of HuH7fhit, 5 mice received subcutaneous transplantation of normal HuH7 and HuH7C as control. The body weight of nude mice and tumor growth were measured. Results: RTPCR and western blot analysis showed that HuH7 cells expressed high level of fhitmRNA and fhit protein after infection with pcDNA3.1(+)/fhit. The growth of HuH7 cells treated with pcDNA3.1(+)/fhit was significantly inhibited. The pcDNA3.1(+)/fhitinfected HuH7 cells showed a significant increase in G0G1 phase and fhitinduced apoptosis in comparison with controls(P<0.05). The growth of transplanted tumor was inhibited markedly by fhit. The results showed that tumors arising from the HuH7fhit cells occurred much later compared to those arising from the HuH7 and HuH7C cells. HuH7fhit cells also displayed slow growth and low tumor volume. The tumor control rates were 83.42% and 84.74%. Conclusion: Tranfer of fhit gene could inhibit the growth of human hepatocellular carcinoma cells and induce cell apoptosis in vitro and in vivo.

　　[KEY WORDS]Hepatocellular carcinoma; Gene therapy; Fragile histidine triad gene

　　1996年Ohta 等[1]采用外显子捕获法(exon trapping)于染色体3p14.2上克隆出fhit基因， 随后许多学者发现在绝大多数肿瘤中存在fhit基因的异常， 认为fhit基因是一重要的肿瘤候选抑癌基因[27],且肝癌细胞系HuH7存在fhit基因的染色体、mRNA和蛋白的异常[8]。 由此，我们自行构建一个包含人脆性组氨酸三联体(fhit)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/fhit,体外转染人肝癌细胞HuH7，以探讨fhit基因在肝癌细胞增殖或凋亡中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　菌株E.Coli DH5α和真核表达载体pcDNA3.1(+)为本室保存;PBluescript SK fhit质粒含fhit基因全长cDNA(由美国Duke 大学Xiaofan Wang教授惠赠);HuH7购自上海中科院细胞库;BALB/c裸小鼠14只，由武汉同济医院实验动物中心提供，鼠龄4～5周，体重18～20 g，雌雄共用，动物质量合格证号为SCXK(鄂)20040010，SPF(specefic pathogen free)条件下饲养。逆转录聚合酶链反应(RTPCR)试剂盒购自日本Takara公司， fhit抗体购自美国Zymed公司， 细胞周期检测试剂盒购自美国Becton Dickinson公司。细胞实验分为空白对照组(HuH7组)、转染空载体组(HuH7C组)和实验组(HuH7fhit组)，动物实验按照随机配对成组设计相应分组。

　　1.2 方法

　　1.2.1 质粒的构建及鉴定

　　酶切鉴定正确的PBluescript SK fhit质粒交由上海生工进行DNA序列测定，在EP管中建立酶切反应: pcDNA3.1(或PBluescript SKfhit)、BamHⅠ、XbaⅠ， 37 ℃水浴酶切2 h， 取上述酶切产物电泳， 将大小为1.0 Kb的fhit基因片断和5.4 Kb线性化的pcDNA3.1用电泳凝胶回收试剂盒回收， 拟构建pcDNA3.1(+)/fhit， 在Ep管中建立质粒重组反应体系:fhit基因片断;线性化的pcDNA3.1;T4ligase，16 ℃水浴12 h， 转化感受态菌DH5α，挑取克隆进行培养和鉴定。

　　1.2.2 细胞培养和转染

　　HuH7细胞用含100 mL/L特优级胎牛血清(Gibco 公司)， 加1.0 mmol/L丙酮酸钠， 0.1 mmol/L非必须氨基酸， 在37 ℃、50 mL/L CO2、饱和湿度下培养,将生长旺盛的HuH7细胞接种于6孔板中， 当细胞密度为70%左右时， 按Lipofectamine2 000(脂质体转染试剂盒)说明书进行pcDNA3.1(+)/fhit的转染， 转染后用G418(500 mg/L)进行筛选， G418(250 mg/L)维持筛选,fhit基因、空载体转染HuH7细胞分别命名为HuH7fhit和HuH7C，亲本细胞HuH7作为未转染对照。

　　1.2.3 RTPCR

　　取G418筛选后的HuH7fhit细胞，用引物扩增fhit基因外显子5外显子9(P1: 51ATGTCGTTCAGA31;P2:51CTGAAAGTACAC31)[9]， 采用TRIZOL法抽提细胞总RNA， 先行反转录， 后进行PCR反应， 产物10 g/L琼脂糖凝胶电泳。PCR反应参数:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min、44 ℃退火1 min、72 ℃延伸45 s，30个循环后72 ℃再延伸7 min。

　　1.2.4 Western印迹法

　　取筛选后的HuH7fhit细胞， 细胞裂解液处理细胞， 离心后取上清，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，120 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳， 将蛋白转至硝酸纤维膜上， 封闭液封闭， 与fhit抗体结合，后用辣根过氧化物酶结合的二抗结合，增强化学发光法(ECL)显色后照相。

　　1.2.5 噻唑蓝(MTT)比色法检测转染前、后细胞增殖能力

　　1×104细胞(每孔200 μL)接种于96孔培养板，每组细胞接种6孔， 设3个平行孔， 加入MTT(5 g/L)液后继续孵育4 h，终止培养再加DMSO,酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(波长为570 nm)。每隔24 h同样以上测定， 连续测定6 d， 观察3组细胞增殖能力变化。

　　1.2.6 流式细胞仪分析细胞周期及凋亡

　　检测前以胰酶消化细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，用预冷的70%乙醇固定，4 ℃过夜. 以PBS洗脱乙醇，并用PBS制备单细胞悬液，碘丙锭(PI)染色后，用流式细胞仪(FCM)分析细胞周期变化及凋亡率。

　　1.2.7 裸鼠抑制瘤试验

　　实验分3组，每组5只裸鼠，分别用于接种转染HuH7、HuH7C和HuH7fhit细胞，用此克隆细胞进行裸鼠背部皮下注射，每只接种细胞数约为1×106个，观察各组试验动物成瘤情况。于接种后每隔1周观察1次肿瘤的体积大小，7周后处死动物，剥离肿瘤，测量肿瘤大小并称瘤重，根据公式V=ab2/2(a为长径，b为短径)计算瘤体积，绘制生长曲线，计算抑瘤率=[(V对照组V实验组)/V对照组]×100%。

　　1.3 统计学处理

　　SPSS11.5统计软件进行，采用t检验和方差分析，数据以(±s)表示， P<0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 质粒的鉴定

　　质粒PBluescript SK fhit送上海生工生物工程公司测序，与GenBank的fhit mRNA序列相符(登陆号:NM_002012),质粒PBluescript SK fhit经双酶切BamHⅠ和XbaⅠ后，琼脂糖凝胶电泳可见1.0 kb和2.7 kb的2条DNA条带(图1),质粒pcDNA3.1(+)/fhit经内切酶BamHⅠ和XbaⅠ后， 琼脂糖凝胶电泳可见1.0 kb和5.4 kb的2条DNA条带(图1)，说明pcDNA3.1(+)/fhit构建成功。

　　2.2 质粒转染前后细胞fhitmRNA的表达

　　转染pcDNA3.1(+)/fhit后， HuH7fhit细胞fhitmRNA阳性，为400 bp条带，而空载体转染细胞HuH7C和亲本细胞HuH7未见此条带的表达(图2)。

　　2.3 质粒转染前、后细胞fhit蛋白的表达

　　转染pcDNA3.1(+)/fhit后，HuH7fhit细胞中有17 kD的fhit蛋白表达，而空载体转染细胞HuH7C和亲本细胞HuH7未见fhit蛋白表达(图3)。

　　2.4 噻唑蓝(MTT)比色法检测转染前后细胞增殖能力的变化

　　fhit基因转染细胞HuH7fhit较空载体转染细胞HuH7C和亲本细胞HuH7的生长速度明显减慢，尤其是达到对数生长期后更加明显，差异有统计学意义(P<0.05)(图4)。

　　2.5 HuH7细胞转染前、后生长周期及凋亡率的变化

　　流式细胞仪分析HuH7细胞转染前后生长周期及凋亡率的变化,结果表明HuH7fhit细胞G2/M期及S期比例明显下降， G0/G1期比例明显增加，凋亡细胞率也明显高于对照组和空质粒转染组(P<0.05,表1)。表1 fhit基因对人肝癌细胞HuH7的细胞周期和凋亡的影响(略)注：和HuH7C比较*P<0.05。

　　2.6 fhit基因对裸鼠出瘤时间、肿瘤体积和肿瘤生长曲线的影响

　　裸鼠移植瘤实验(表2和图5)结果显示，HuH7与HuH7C的成瘤潜伏期、生长速度、肿瘤体积和肿瘤重量无明显差异(P均>0.05)。与HuH7和HuH7C比较, HuH7fhit细胞成瘤时间明显推迟，生长慢，肿瘤体积和瘤重小，差异有统计学意义(P均<0.05)，抑瘤率分别为85.17%和87.14%。提示fhit能在体内抑制人肝癌细胞的增殖，具有较强的抗肿瘤活性。表2 裸鼠平均成瘤时间及处死后的平均瘤重(略)

　　3 讨论

　　目前普遍认为,fhit是第一个将脆性位点和肿瘤联系起来的抑癌基因,并且fhit基因异常是肿瘤发生和发展过程中的早期事件[1012],脆性位点发生断裂会使包含脆性位点的fhit基因发生断裂、变异和失活而导致细胞异常增生，与许多其他肿瘤相似,肝癌中存在fhit基因的高度变异或缺失。Yuan等[8]发现64.3%(9/14)的肝癌细胞系存在fhit基因表达下调，其中4个出现fhit mRNA下调的肝癌细胞系均不表达fhit蛋白;原位杂交发现29.4%(10/34)的肝癌组织中存在fhit基因第5外显子的缺失，61.5%(8/13)的肝癌细胞系中存在LOH或染色体转位;免疫染色发现50%(5/10)的肝癌细胞系中无fhit蛋白的表达。Gramantieri等[10]对28 例HCC患者的癌组织和非癌组织、10例正常肝组织研究发现，异常fhit转录为46.4%(11例发生于肝癌组织、2例发生于HCC患者的非肝癌组织)，而10例正常肝组织未发现异常转录。最近的研究表明，在多种因素诱导的大鼠肝癌发生和发展中也发现有明显的fhit基因异常[13]。

　　fhit可能主要通过使APnA 水解为ATP 和AMP来参与调节体内APnA量的变化。APnA是信号转导分子,由于发生fhit基因变异,肿瘤细胞失去或减弱了fhit将APnA降解为AMP 和ATP的能力,导致细胞内APnA发生积累,细胞内大量的APnA积累能够加强生长信号转导,阻断抑制生长途径或凋亡通道而导致癌变,另外,fhit蛋白能作用于mRNA帽类似物,影响重要基因mRNA的翻译,脱帽功能的丧失也可能引起肿瘤[9]。Siprashvil[13]等将野生型fhit和通过定位突变技术制成的没有Ap3A水解酶活性的突变型fhit转染到缺少fhit的肿瘤细胞中,发现fhit基因异常并不能使细胞获得生长优势,而可能只是使细胞获得克隆扩增的选择优势,同时发现他们在抑制成瘤性上差异无显著性。因此,认为fhit蛋白与其底物结合抑制肿瘤发生可能比Ap3A水解酶的活性更重要,有关fhit蛋白的功能及作用机制有待进一步研究。在本实验中，我们向人肝癌细胞系HuH7转染含有全长fhitcDNA的真核表达载体，实验性干预肝癌细胞系HuH7的基因表达，以观察转染后肝癌细胞系HuH7生物学性状的改变,结果表明，转染成功的HuH7细胞，其fhit基因的mRNA、蛋白表达阳性。 而空载体转染细胞HuH7C和亲本细胞HuH7未见fhit基因的mRNA、蛋白表达。进一步检测转染成功的HuH7细胞的生物学性状的变化，我们发现，成功转染fhit基因的肝癌细胞其体外增殖能力下降，G2/M期及S期比例明显下降，G0/G1期比例明显增加，凋亡细胞率也明显高于对照组和空质粒转染组。初步证实了fhit基因有诱导肝癌细胞凋亡的作用。

　　本文在裸鼠体内建立皮下移植肝癌模型，结果证实fhit可抑制肿瘤生长。理想的人类肿瘤动物移植模型的建立是研究肿瘤生物学和抗肿瘤实验治疗的重要工具，本实验模型的成功率为100%，为后续原位肿瘤模型实验奠定了良好的基础。

　　通过本实验研究，我们认为fhit基因可能通过使细胞阻滞于G1期，在其他凋亡诱导因子的协同作用下，诱发肿瘤细胞发生凋亡。本实验也证明了这一点，为临床治疗肝癌提供一种方法。

　　【参考文献】

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