CD117阴性胃肠道间质瘤的临床病理及超微结构分析

　　作者：姚婵, 施公胜 作者单位：(南通大学附属医院病理科，南通226001)

　　【摘要】 目的：探讨CD117阴性胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumours, GIST)的临床病理及超微结构特征。方法：采用HE、免疫组化(EnVision法)及电镜技术观察16例CD117阴性GIST，并运用Western blot技术检测4例GIST中PKC-θ蛋白的表达。结果：16例患者中男11例，女5例，年龄32~67岁，平均54岁。随访9例，死亡1例。组织学形态可分为梭形细胞为主型、上皮样细胞为主型及梭形和上皮样细胞混合型。肿瘤细胞免疫组化阳性表达为PKC-θ 87.5%(14/16)，CD117 0%(0/16)，CD34 62.5%(10/16)，Des 6.2%(1/16)，θ-SMA 31.2%(5/16)，S-100 18.8%(3/16)。电镜下GIST的超微结构特点与卡哈尔细胞相似。Western blot 证实了PKC-θ在CD117阴性GIST中的表达。结论：CD117阴性GIST可通过免疫标记PKC-θ和及电镜检测做出诊断。

　　【关键词】 胃肠道间质瘤;CD117;蛋白激酶C-θ;超微结构

　　Clinicopathological and ultrastructural analysis of gastrointestinal stromal tumours negative for CD117

　　YAO Chan， SHI Gongsheng (Department of Pathology,the Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001)

　　[Abstract] Objective: To investigate the clinicopathological and ultrastructural features of gastrointestinal stromal tumours (GIST) negative for CD117. Methods: Sixteen cases of GIST negative for CD117 were investigated with HE staining, EnVision immunostaining and electron microscopy. Western blot was used to test the expression of PKC-θ on 4 cases of GIST. Results: Eleven patients were male and five were female, 32~67 years in age (average 54 years). Nine patients were followed up and one was dead. GIST tended to fall into three categories of morphology: spindle, epithelioid and mixed cell. Immunohistochemically, the tumours were positive for PKC-θ 88%(14/16), CD117 0%(0/16), CD34 63%(10/16), Des 6%(1/16), θ-SMA 31%(5/16) and S-100 19%(3/16) respectively. The ultrastructural feature of one case was similar to that of the interstitial cell of Cajal (ICC). Western blot confirmed the expression of PKC-θ on GIST negative for CD117. Conclusion: GIST negative for CD117 could be diagnosed by immunohistochemistry for PKC-θ and ultrastructural findings.

　　[Key words] Gastrointestinal stromal tumours; CD117; Protein kinase C-θ; Ultrastructure胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumours，GIST)是一组由未分化或多潜能的梭形或上皮样细胞组成的消化道间叶源性肿瘤[1]。目前GIST的确诊依赖于c-kit蛋白(CD117)阳性表达，但少部分具有典型临床病理特征的GIST不表达CD117，因此CD117阴性GIST的诊断相对困难。笔者收集16例CD117阴性GIST，结合文献对其临床病理学特征、免疫组化及超微结构进行研究，以期提高临床及病理医师对CD117阴性GIST的认识，避免误诊误治。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源 收集南通大学附属医院1997~2008年存档及会诊的GIST病例共135例，从中找出CD117阴性病例16例(最初病理诊断为平滑肌瘤2例，平滑肌肉瘤1例，神经鞘瘤1例)，其中男11例，女5例，年龄32~67岁，平均54岁。临床无症状体检(5例)、发现腹部无痛性包块(6例)、便血、腹痛(4例)或肠梗阻(1例)而就诊。所有病例术前均未经放射治疗或化学治疗。9例获得随访资料，7例失访。

　　1.2 方法 标本用4%甲醛固定，石蜡切片，行HE染色、光镜观察。免疫组织化学采用EnVision二步法，高温高压抗原修复，DAB-H2O2显色。第一抗体为蛋白激酶C-theta(PKC-θ)、c-kit蛋白(CD117)、CD34、肌间线蛋白(Desmin)、平滑肌肌动蛋白(θ-SMA)、S-100蛋白，PKC-θ抗体购自Dako公司，其它抗体均购自福州迈新生物技术开发有限公司。1例取新鲜肿瘤组织，2.5%冷戊二醛固定液固定，4℃过夜，冷缓冲液漂洗1 h，1%锇酸固定1 h，丙酮剃度脱水后，Epon812树脂包埋，制成70 nm超薄切片，经醋酸铀和柠檬酸铅双重染色后，应用JEM-1200透射电镜观察。5例新鲜肿瘤组织(4例GIST，1例平滑肌瘤，各约10 mg)采用10%SDS-PAGE 凝胶电泳，然后将SDS-PAGE分离的凝胶置于转移槽中转移,将转移后载有蛋白质的NC膜用含有0.01%Tween的PBS漂洗2次，加入1∶200稀释的PKC-θ单克隆抗体，温育24 h，DAB显色后拍摄滤膜照片。

　　2 结 果

　　2.1 病理学观察 多数肿瘤表现为胃肠壁肌层内的肿块，13例肿瘤自胃肠壁固有层向外生长，只有细蒂与胃肠壁固有层相连，表现为浆膜下肿块。3例向腔内生长，使黏膜隆起，引起继发性溃疡。1例表现为大网膜肿块，1例表现为肠系膜肿块。肿瘤直径1~40 cm，平均7.2 cm，多数为境界清楚的孤立性圆形或椭圆形肿块，2例呈分叶状、多发性。肿瘤切面呈实性，灰白灰红色，由于血管、胶原化、自溶、出血等变化而呈颗粒状或小凹陷。2例肿瘤见出血、坏死、囊性变等继发性改变。

　　光镜下，16例GIST中9例表现为梭形细胞为主型，瘤细胞胞质略呈嗜酸性或嗜碱性，胞核拉长呈短梭、胖梭或长杆状，核端尖或平钝，可见核端空泡(图1)，其中1例瘤细胞局灶轻度异型增生，核分裂象<5个/50HP，1例瘤组织中见大片坏死，伴有出血及囊性变，核分裂象>5个/50HP;6例GIST表现为上皮样细胞为主型，瘤细胞圆形、多角形或星状，胞质淡染，可见显著空泡，核圆形，核周形成空亮的区域，或将细胞核推向一侧呈镰刀形，形成印戒样细胞(图2);1例表现为梭形和上皮样细胞混合型，两种细胞形态混合存在，瘤细胞密集，核有异型，见不规则片状坏死，核分裂象>10个/50HP。

　　2.2 免疫表型 肿瘤细胞免疫组化阳性表达为PKC-θ 87.5%(14/16)(图3)，CD117 0.0%(0/16)， CD34 62.5%(10/16)，Des 6.2%(1/16)，θ-SMA 31.2%(5/16)，S-100 18.8%(3/16)。临床资料及免疫组化结果见表1。

　　2.3 GIST的Western blot蛋白分析结果 Western blot检测结果显示4例GIST均有PKC- 蛋白的条带，其分子量十分接近，约为80 kDa，而1例平滑肌瘤则无PKC- 蛋白表达(图4)。

　　2.4 超微结构观察 例1电镜下见瘤细胞呈梭形，宽约8～10 m，长约25～35 m。核卵圆或不规则形，常染色质丰富。胞质丰富，粗面内质网多见，线粒体发达，并含中等量微丝(图5)。电镜诊断：“胃”间质瘤。

　　2.5 随访 9例随访患者中5例手术后辅以格列卫治疗，随访6～46个月，患者健在;4例手术后未经格列卫治疗的患者，随访10～33个月，3例病情稳定，1例死亡。

　　3 讨 论

　　GIST是消化道最常见的间叶组织源性肿瘤，目前认为它起源于消化道的卡哈尔细胞(intestinal cell of Cajal, ICC)。GIST约75%发生于50岁以上老年人，发病的中位年龄为58岁，无明显性别差异[2]。约50%发生在胃，25%发生在小肠，不足10%发生于食管、结肠及直肠[3]。最常见的临床症状是中上腹部不适和腹部肿块及便血，小肠GIST可表现为疼痛、便血或肠梗阻。GIST组织细胞学形态可分为梭形细胞为主型(70%)、上皮样细胞为主型(20%)、梭形和上皮样细胞混合型(10%)[4]。

　　GIST在组织形态上易与平滑肌瘤、神经鞘瘤、炎症性肌纤维母细胞性肿瘤相混淆。CD117表达缺失时，GIST的诊断除依赖其典型的临床病理特征外，尚须依赖基因突变检测及其他特异性标记物，此外，电镜下肿瘤间质“团丝样纤维”(skeinoid fiber, SF)也有助于GIST的诊断。研究表明，大多数的GIST是由c-kit基因的突变所致，据报道约75%~80%的GIST发生KIT基因突变[5]。多数突变位于近膜区(11号外显子)，部分突变发生于KIT的细胞外区(8号和9号外显子)以及激酶Ⅰ区和Ⅱ区(13号和17号外显子)[5-6]。Rubin等[6]发现在20%~25%的缺乏KIT突变的GIST中，约1/3(8%)有血小板源性生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor alpha, PDGFRα)突变，突变出现在第12号和18号外显子。PDGFRα基因的突变与c-kit基因的突变相互独立，有c-kit突变者均无PDGFR突变，反之亦然。采用聚合酶链反应(PCR)扩增直接测序的方法检测c-kit和PDGFRα基因的突变有助于GIST的诊断。

　　Nielsen等[7]应用DNA微阵列研究发现PKC-θ特异性表达于GIST。Blay等[8]通过Western blot技术检测发现发生PDGFRα基因突变的GIST不表达CD117而表达PKC-θ，提示PKC-θ可能是PDGFRα突变的特定标记物。PKC家族是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族之一，参与多种细胞功能的调节，其中PKC-θ是一个钙离子非依赖性蛋白激酶，PKC-θ基因定位于人类10号染色体短臂，在细胞周期G1期起重要作用，缺失将影响细胞正常分化。此外，60%~70%的GIST还可表达CD34，因此对于具有典型临床病理特征的GIST，CD117阴性表达时，CD34阳性表达也支持GIST的诊断。本组病例均具有GIST典型的临床病理特征，而CD117表达阴性，其中仅10例CD34强阳性表达，其余病例均依赖组织形态做出最初诊断。本研究中88%的GIST表达PKC-θ，Western blot蛋白检测证实GIST中有PKC-θ蛋白表达，证明PKC-θ是诊断GIST的有用标记物，尤其是对CD117阴性的病例，PKC-θ和CD117联合应用可提高GIST的检出率。本组研究对1例GIST进行超微结构分析，核卵圆或不规则形，常染色质丰富。胞质丰富，粗面内质网多见，线粒体发达，并含中等量微丝，与Min等[9]报道的卡哈尔细胞的特点相似。

　　手术是GIST的主要治疗方式，但约50%的患者术后5年复发或转移[10]。甲磺酸伊马替尼即格列卫是一种高选择性的酪氨酸激酶受体小分子抑制剂，其作用的靶点主要包括KIT和PDGFRα等受体，能选择性的阻断受体的活化，抑制肿瘤细胞无序增殖和诱导细胞调亡。本组16例GIST患者均予以手术治疗，9例随访患者中5例手术后辅以格列卫治疗，随访6~46个月，患者健在;4例手术后未经格列卫治疗的患者，随访10~33个月，3例病情稳定，1例死亡，与Bauer等[11]报道一致。

　　【参考文献】

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　　[7] Nielsen TO,West RB,Linn SC, et al. Molecular characterisation of soft tissue tumours: a gene expression study[J].Lancet, 2002,359(9314) :1301-1307.

　　[8] Blay P,Astudillo A,Buesa JM,et al.Protien kinase C theta is highly expressed in gastrointestinal stromal tumors but not in other mesenchymal neoplasias[J]. Clin Cancer Res, 2004, 10( 12 Pt 1) : 4089-4095.

　　[9] Min KW,Sook Seo I.Interstitial cells of Cajal in the human small intestine: immunochemical and ultrastructural study[J]. Ultrastruct Pathol,2003,27(2):67-78.

　　[10] Streutker CJ, Huizinga JD, Driman DK,et al. Interstitial cells of Cajal in health and disease.Part Ⅱ:ICC and gastrointestinal stromal tumours[J].Histopathology, 2007, 50(2): 190-202.

　　[11] Bauer S,Corless CL,Heinrich MC,et al.Response to imatinib mesylate of a gastrointestinal stromal tumor with very low expression of KIT[J].Cancer Chemother Pharmacol, 2003,51