风湿性心脏病慢性心房颤动患者钙转运调控蛋白和钙激活中性蛋白酶基因转录的表达改变

　　作者：许国军，汤宝鹏，库热西·玉努斯，伊力哈木江·沙比提， 木拉提·阿布提热合曼，程祖亨 作者单位：乌鲁木齐市新疆医科大学第一附属医院心内科，新疆 乌鲁木齐 830054

　　【摘要】 目的 测定心房肌钙转运调控蛋白和钙激活中性蛋白酶(calpain 1)的mRNA表达，探讨风湿性心脏瓣膜病(风心病)心房颤动(房颤)患者心房肌电重构和结构重构以及心功能下降的分子生物学机制及其在房颤发生、维持中的作用。方法 采集风心病窦性心律组患者12例和房颤组患者16例的右心耳组织，应用半定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法，测定心房肌钙转运调控蛋白和calpain1的mRNA表达水平。结果 与窦性心律组相比，房颤组L型电压依赖钙通道a1c亚基(LVDCCa1c)、肌浆网Ca2+ATP酶、兰尼碱受体(RYR2)的mRNA表达水平明显下调(均为P<0.01)，三磷酸肌醇受体(IP3R1) 的mRNA表达水平上调(P<0.05)，房颤组心房肌calpain1的mRNA表达水平上调(P<0.05)，且与LVDCCa1c的mRNA表达呈负相关(r=-0.583，P<0.05)。结论 房颤患者心房肌钙转运调控蛋白和calpain1转录水平调控失衡可能是心房肌电重构和结构重构以及心功能下降的分子生物学机制之一，与房颤的发生和维持有关。

　　【关键词】 心房颤动,钙转运调控蛋白,钙激活中性蛋白酶; 基因表达

　　Abstract：Objective To investigate the molecular mechanisms of chronic atrial fibrillation (AF) by assessing gene expression of calcium handling proteins and atrial calpains in AF patients. Methods A hundred microgram of tissue of right atrial appendages was obtained from 16 rheumatic heart disease patients with AF and 12 matched rheumatic heart disease patients with sinus rhythm (as control) during cardiac operation. The mRNA expression of calcium handling proteins and atrial calpains were assessed by semiquantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR) and normalized to the mRNA level of glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase. Results mRNA level of calpain1 was significantly increased (P<0.05) and mRNA level of LVDCCa1c was significantly decreased (P<0.01 ) in AF group than in sinus rhythm group. mRNA level of LVDCCa1c was negatively correlated to that of calpain1(r=-0.583，P<0.05 ). Compared to sinus rhythm group, AF group had significantly decreased levels of sarcoplasmic reticulum(SR) calcium adenosine triphosphatase (Ca2+ATPase) and ryanodine receptor type2mRNA (P<0.01 ) and significantly increased level of inositol triphosphate receptor type1mRNA (P<0.05). Conclusions Chronic AF is predominantly accompanied by abnormal regulation in the mRNA expression of proteins influencing the calcium homeostasis and atrial calpain1, which are related to both electrical remodeling and structural change and may influence the initiation and maintenance of AF.

　　Key words： Atrial fibrillation; Calcium handling proteins; Calpains; Gene expression

　　心房颤动(房颤)主要的特征是电重构和心功能下降。房颤时心房肌电重构在房颤的自身维持中发挥重要作用。研究显示，细胞内钙超载在房颤电重构中起重要作用[1]。电重构是可逆的，相比之下，心房的收缩功能在转为窦性心律后却恢复得较慢[2]，这表明除电重构以外，还有其他因素影响着房颤患者心房的功能。钙激活中性蛋白酶(Calpains)是一类钙离子依赖性的中性蛋白酶，激活后可以使收缩蛋白部分降解，肌丝反应性降低，引起心肌收缩功能的抑制[3]。本研究通过观察慢性房颤患者心房肌钙转运调控蛋白和calpain1的mRNA表达改变，探讨房颤患者心房肌电重构和结构重构以及心功能下降的分子生物学机制及其在房颤发生维持中的作用。

　　1 对象和方法

　　1.1 研究对象

　　2006年1月至2006年8月在新疆医科大学第一附属医院接受开胸换瓣手术的28例风心病患者，男性10例，女性18例，年龄 (41.62±8.56)岁(32～60岁)。按其有无房颤分为：窦性心律(窦律)组12例，房颤组16例，房颤持续时间超过6月。术前1周每例行心电图、超声心动图等常规检查，部分患者行冠状动脉造影排除冠心病。所有病例均无肝肾功能损害、电解质紊乱及感染，无高血压、糖尿病，心功能均在Ⅱ～Ⅲ级(NYHA分级)，半年内均未应用钙离子拮抗剂。

　　1.2 研究方法

　　1.2.1 标本采集 心脏手术中建立体外循环，心脏停跳前获取右心耳组织约100 mg，除去血液和脂肪组织后迅速置入液氮，然后转入-80℃深低温冰箱冻存备用。

　　1.2.2 RNA提取 取心房组织约100 mg，用TRIZOL(Invitrogen公司)一步法提取组织总RNA，将RNA溶于40 μl去核酸酶(DEPC处理)的水中，-80℃冻存备用。所有标本吸光度D(λ)260/D(λ)280均为1.7～2.0。

　　1.2.3 半定量逆转录聚合酶链反应(RT PCR) (1)取2 μg总RNA逆转录成cDNA;(2)引物设计与合成：检索基因库各目标基因和三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)cDNA序列，由TaKaRa公司合成。LVDCCa1c上游：5'ACA AGA ACC AGC GAC AGT G3'下游：5'GGG TTT GAA GGC AAT GAG C3'，扩增片段 278 bp;Ca2+ATP酶 上游：5'TTG CAT TGC AGT CTG GAT CA3'下游：5'TCC AAA GCA GAG TCA TTA CA3'，扩增片段484 bp;RYR2上游：5'AAG TGC CAG AGT CAG CAT TC3'下游：5'AGT AGT ATC CAA TGA TGC AG3'，扩增片段453 bp;IP3R1上游：5'TTA GCA AGA TGG CGA AAG G3'下游：5'GAG CAG GAC ACG GAG AAA GG3'，扩增片段453 bp;Calpain1上游： 5'GCA CAG ACA TCT GCC AGG GAG C3'下游： 5'GCC TGT GAA GTC CTC AAA GCC C3'，扩增片段 332 bp;GAPDH上游：5'CCC CAC ACC ATC TTC CAG GAG CG3'下游：5'GGC AGG GAT GAT GTT CTG GAG AGC c3'，扩增片段411 bp;(3)PCR反应体系(25 μl)：cDNA2 μl(约0.25μg)，25 mmol/L MgCl2 1.5 μl，10×Buffer 2.5 μl，10 mmol/L dNTP 0.5 μl，Taq酶2 U，目标基因上、下游引物各0.2 μmol/L，内参照基因上、下游引物各0.1 μmol/L，加去离子水至25 μl。(4)反应条件：94℃预变性5 min，随后进入PCR循环，94℃变性30 s，褪火45 s，各目标基因褪火温度依次为54℃、56.8℃、58.5℃、56.3℃、60.7℃、54℃，72℃延伸60 s，30个循环后72℃延伸10 min。PCR反应试剂购自TaKaRa公司。(5)阴性对照：反应体系中未加入模板总RNA，代之以去离子水，其他如反应体系、反应条件等无改变。

　　1.2.4 电泳及图像的半定量分析 取PCR产物5 μl，用1.5%琼脂糖凝胶电泳，经溴化乙锭染色，在BIORAD凝胶成像系统上扫描，测目标基因和内参照基因的电泳条带灰度积分，以二者比值代表目标基因的相对表达含量。

　　1.3 统计学处理

　　各指标测值以均数±标准差(±s)表示，两组间比较采用t检验，变量间相互关系采用直线相关分析。统计处理均由SPSS11.5软件包完成，P<0.05有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 一般资料

　　如表1所示，除年龄外，两组间其他临床资料如性别、左房内径、右房内径、左室射血分数和心功能HYHA分级等差异无统计学意义。

　　2.2 钙转运调控蛋白和calpain 1的mRNA表达注：HYHAC为纽约心脏病协会心功能分级;与窦性心律组比较，aP<0.05 Ⅰ中图15号为窦律组，6～10号为房颤组;Ⅱ中1～5号为窦律组，6～10号为房颤组;Ⅲ中1～5号为房颤组，6～10号为窦律组;Ⅳ中1～5号为窦律组，6～10号为房颤组;Ⅴ中1～5号为房颤组，6～10号为窦律组;Ⅵ为内参照基因。

　　标基因和内参照基因GAPDH的扩增条带位置与理论值相符。

　　2.3 房颤组钙转运调控蛋白mRNA表达

　　与窦律组相比，房颤组LVDCCa1c、肌浆网钙调控蛋白Ca2+ATP酶、RYR2的mRNA表达水平明显下调(均为P<0.01)，IP3R1 的mRNA表达水平上调(P<0.05)。与窦律组相比，房颤组心房肌calpain1的mRNA表达水平上调(P<0.05)，且与LVDCC a1c 的mRNA表达呈负相关(r=-0.583，P=0.019)(表2)。表2 两组间目标基因mRNA水平的比较注：与窦性心律组比较，aP<0.05， bP<0.01。

　　3 讨论

　　心肌细胞电活性的基本表现为动作电位，因此对离子通道的研究是房颤的心电生理和心电药理研究的出发点。疾病状态和心律失常可改变原有的心电生理特性，即形成电重构，机制为离子通道特性的改变，由此缩短动作电位时限和影响动作电位时限对频率变化的适应性。心肌细胞内若钙离子通道下调，ICa内流减少，必然会使动作电位时限缩短，相应的有效不应期也缩短，使心房肌易于接受高频冲动以及心房内多源折返的建立，这是引起房颤的重要的电生理变化。L型钙通道是影响心房兴奋性和不应期变化的最主要因素。本研究结果表明，与窦律组相比，慢性房颤患者心房肌细胞膜LVDCCa1c 的mRNA表达水平明显下降，为上述理论提供了直接证据。与以往文献报道相近[4,5]。

　　房颤具有电重构和结构重构的特征。房颤的发生和持续过程中有许多离子流、受体和调节机制参与其中，并发生了结构和功能的调整[6]。房颤可引起心房肌细胞内Ca2+调控异常[7]，同时钙通道的调控异常又可引起离子电流改变，从而引起动作电位时限以及心脏不应期的改变。Ca2+的调控机制包括钙泵(Ca2+ATP酶)和钙释放通道(兰尼碱受体)，它们的主要作用是调控胞浆与肌浆网中钙的运输。本研究结果表明，慢性房颤患者心房肌肌浆网Ca2+ATP酶和RYR2的mRNA表达水平明显下调，提示慢性房颤患者心房肌肌浆网钙泵功能减低，使细胞内Ca2+再摄取减少导致细胞内Ca2+超载，与RYR2的mRNA表达下调共同作用使细胞内Ca2+平衡失调[8]，后者又进一步使肌浆网Ca2+调控蛋白表达异常，形成恶性循环，使房颤得以维持，即房颤诱发房颤。

　　三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)是细胞内的一种第二信使，与相应受体结合后可激活内质网上IP3受体钙释放通道，使细胞内Ca2+浓度升高而激活钾通道，后者一方面可促使心肌细胞复极过程缩短从而容易导致快速性心律失常的发生;另一方面细胞内Ca2+浓度升高可使细胞膜ICa电流减弱，进一步缩短有效不应期，使心脏易于激动[9]。本研究结果显示，相对于窦性心律者，房颤患者心肌细胞IP3R1的mRNA表达水平上调，故形成IP3受体过量表达增加了细胞内钙的不稳定性，在房颤产生和维持中起重要作用。

　　近年来研究表明，calpain 1激活后能够部分降解收缩蛋白，引起心肌收缩功能下降，并影响心肌细胞结构和通道蛋白水平，与房颤心房电重构和结构重构有关。导致房颤发生电重构和结构重构的一个主要原因是Ca2+的变化，心房发生的组织结构变化是钙超载激活蛋白水解酶的结果，激活的calpain 1与肌丝直接作用后能够抑制肌丝的最大收缩力，降低肌丝的敏感性，calpain 1不仅使肌钙蛋白的亚单位I(TnI)发生降解，肌钙蛋白的亚单位T(TnT)也发生了降解。在离体缺血再灌注模型中，用不同calpains的抑制剂(Ieupeptin和MDL28170)可以减轻心肌收缩功能受抑制的程度，细胞损伤和TnI降解明显减轻[10]，这表明calpains介导的TnI降解可能与心肌细胞损伤有关。本研究结果表明，慢性房颤患者心房肌calpain 1的mRNA表达水平较窦律者上调，为上述理论提供了直接证据。

　　在阵发性房颤和持续性房颤的患者中，随着钙离子浓度的增加，calpain 1被激活， calpain 1多分布于细胞核、细胞浆和闰盘，calpain 1的激活与心房有效不应期缩短，心肌细胞结构变化和通道蛋白Mink、Kv1.3、Kv1.5及L型钙通道水平下调有关[11]。本研究结果表明，慢性房颤患者心房肌LVDCCa1c 的mRNA表达明显下降，且与calpain 1的mRNA表达呈负相关，故笔者认为calpain 1的激活与心房肌细胞膜L型电压依赖钙通道蛋白水平下调可能存在相关性，上述结果表明，房颤过程钙超载的出现及其介导的calpain1的激活是导致心肌细胞蛋白水平下调和心肌收缩功能下降的因素之一。与Goette等[12]研究结果相近。

　　【参考文献】

　　[1]Brundel BJ, Henning RH, Kampinga HH, et al. Molecular mechanisms of remodeling in human atrial fibrillation[J]. Cardiovasc Res, 2002,54: 315.

　　[2]Schotten U, Haase H, Frechen D, et al, The Ltype Ca2+ channel subunitsa1c and β2 are not downregulated in atrial myocardium of patients with chronic atrial fibrillation [J].J Am Coll Cardiol, 2003, 35: 437.

　　[3]Boll R, Marban E, Huston R, et al. Molecular and cellular mechanisms of myocardial stunning [J]. Physiol Rev，1999,79：609634.

　　[4]Manios EG, Kanoupakis EM, Chlouverakis GI, et al. Changes in atrial electrical properties following cardioversion of chronic atrial fibrillation: Relation with recurrence[J]. Cardiovasc Res,2004,7: 244253.

　　[5]Klein G, Schroder F, Vogler D, et al. Increased open probability of single cardiac Ltype calcium channels in patients with chronic atrialfibril lation. Role of phosphatase 2A[J]. Cardiovasc Res,2003, 59:3745.

　　[6]Thijssen VL, van der Velden HM, van Ankeren EP,et al. Analysis of altered gene expression during sustained atrial fibrillation in the goat[J]. Cardiovasc Res,2002,54:427437.

　　[7]Ehrlich JR, Cha TJ, Zhang L, et al. Characterization of a hyperpolarizationactivated timedependent potassium current in canine cardiomyocytes from pulmonary vein myocardial sleeves and leftatrium[J]. J Physiol, 2004, 557:583597.

　　[8]Cao KJ, Xia XJ, Shan QJ, et al, Changes of sarcoplasmic reticular Ca2+ATPase and IP3I receptor mRNA expression in patients with atrial fibrillation[J]. Chin, Med J, 2002,115:664.

　　[9]Yamada J, Ohkusa T, Nao T, et al. Up regulation of inosistol 1,4,5 trisphosphate receptor expression in atrial tissue in patients with chronic atrial fibrillation[J].J Cardiol, 2002,39:5758.

　　[10]Brundel BJ, Kampinga HH, Henning RH. Calpain in hibition prevents pacing induced cellular remodeling in a HL1 myocyte model for atrial fibrillation. Cardiovasc Res, 2004,62:521528.

　　[11]Brundel B, Ausma J, Van Gelder IC, et al. Activation of proteolysis by calpains and structural changes in human paroxysmal and persistent atrial fibrillation [J]. Cardiovascular Research, 2002, 54: 380.

　　[12]Goette A, Arndt M, Rocken C, et al. Calpains and cytokines in fibrillating human atria[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2002,283:H264.