线粒体ATP敏感性钾通道开放剂二氮嗪对大鼠缺血心肌细胞的保护作用

　　作者：刘蔚，李莹莹 ，张雁芳，汪 海 作者单位：卫生部北京医院心内科，北京100730

　　【摘要】 目的 评价线粒体ATP敏感性钾通道(mito KATP)开放剂二氮嗪对缺血损伤的心肌细胞超微结构和死亡率的影响。方法 选用Wistar大鼠30只，随机分为正常对照组、心肌细胞损伤模型组(皮下注射异丙肾上腺素5 mg/kg)和二氮嗪20 mg/kg组。24 h后处死动物，观察心肌细胞超微结构的改变。结果 异丙肾上腺素皮下注射可以引起心肌细胞超微结构明显受损，预先给予二氮嗪口服可以减轻超微结构的损伤。二氮嗪10～100 μmol/L可以降低缺血心肌细胞的死亡率，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论 二氮嗪对缺血损伤的心肌细胞具有保护作用。

　　【关键词】 线粒体ATP敏感性钾通道,二氮嗪,心肌缺血

　　Abstract：Objective To evaluate the effects of mitochondrial ATPsensitive potassium channel opener diazoxide on ultrastructural changes in myocardial cells and myocyte mortality in isoproterenolinduced myocardial ischemic rats. Methods Thirty Wistar rats were randomly divided into 3 groups: control group, myocardial ischemic group (with 5 mg/kg isoproterenol injection subcutaneously) and experimental group (20 mg/kg diazoxide injection before the ischemic injure). Results Isoproterenol injection could damage the myocardial cell ultrastructures, which could be mitigated by preconditioning diazoxide injection. 10100 μmol/l diazoxide could significantly decrease the mortality of ischemic myocardial cells compared to the control group (P<0.01). Conclusions Mitochondrial ATPsensitive potassium channel opener diazoxide has a cardioprotective effect on myocardial ischemia.

　　Key words： Mitochondrial ATPsensitive potassium channel; Diazoxide; Myocardial ischemia

　　缺血性心脏病是严重危害人类健康的疾病，其治疗措施的研究一直是人们关注的热点，抗心肌缺血药物仍是首选的治疗措施。1991年Inoue等[1]发现大鼠肝细胞内存在着线粒体ATP敏感性钾通道(mito KATP)，以后研究证实心肌mito KATP开放具有心脏保护作用，mito KATP是心脏保护的重要靶点。二氮嗪是一种苯并噻二嗪类衍生物，近来研究表明，二氮嗪是一种mitoKATP开放剂，具有抗缺血缺氧损伤的心脏保护作用[2,3]。为进一步评价二氮嗪的药理学特点，本研究在大鼠心肌缺血模型上观察二氮嗪对心肌细胞超微结构和细胞死亡率的影响，为mito KATP开放剂作为抗心肌缺血药的应用提供理论和实验基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物

　　选用雄性Wistar大鼠30只，体重220～280 g，由军事医学科学院动物中心提供。动物饲养在室温21～22℃的饲养房内，保持湿度45%～55%左右，自由饮食水，12 h黑暗/光照。

　　1.2 药品、试剂和仪器

　　二氮嗪，5羟基癸酸酯(5HD)和胶原酶(I型)，美国Sigma公司。异丙肾上腺素(ISO)，上海禾丰制药公司。矿物油，美国Promega公司。Philips EM400T型透射电子显微镜，荷兰。

　　1.3 动物模型的制备和分组

　　ISO致大鼠心肌损伤模型的制备[4]：将大鼠随机分为正常对照组、心肌细胞损伤模型组(ISO损伤组，皮下注射ISO 5 mg/kg)和二氮嗪20 mg/kg组。每组动物10只。二氮嗪连续口服3 d，1次/d。第四天开始，除正常对照组外，余两组动物皮下注射ISO 5 mg/kg，24 h后处死动物，留取心脏进行超微结构观察。

　　心肌细胞急性分离和细胞缺血模型的制备：根据文献[5]的方法。将心肌细胞分成单纯缺血组、二氮嗪10 μmol/L组、二氮嗪100 μmol/L组和二氮嗪100 μmol/L+5羟基癸酸酯(5HD)500 μmol/L组。给药组在缺血前用药物孵育15 min。每组6只大鼠。

　　1.4 电镜标本的制作

　　取大鼠之左心室近心尖部心内膜下层心肌，切成1 mm3的小块，3%戊二醛和1%锇酸双重固定(pH 7.4，4℃)，逐级乙醇和丙酮脱水，包埋，制作超薄切片，柠檬酸铅和醋酸双氧铀染色，电镜下观察心肌细胞超微结构。

　　1.5 统计学处理

　　应用SPSS10.0软件进行统计学分析，计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 二氮嗪对缺血损伤心肌组织超微结构的影响

　　正常对照组大鼠心肌组织超微结构见图1A，表现为肌纤维排列规整，线粒体结构完整。大鼠皮下注射ISO 5 mg/kg后，心肌细胞超微结构明显受损(图1B)，表现为肌节I带消失，Z线增宽、弯曲。受累严重的心肌细胞可见肌节极度缩短或Z线相互融合，肌丝断裂，肌原纤维广泛破坏或丧失。线粒体普遍明显肿胀，嵴溶解或消失。预先给予二氮嗪20 mg/kg后，ISO所致的心肌细胞损伤程度明显减轻(图1C)。

　　2.2 对大鼠心肌细胞死亡率的影响

　　在心肌细胞缺血实验中，单纯缺血对照组心肌细胞死亡率为53.5%，预先用二氮嗪10 μmol/L和100 μmol/L孵育后，细胞死亡率与对照组比较下降了29.0%(P<0.01)和32.9%(P<0.01)。予mito KATP阻断剂5HD 500 μmol/L孵育后，再用二氮嗪100 μmol/L孵育，则细胞死亡率为52.0%，与对照组比较差异无统计学意义。提示二氮嗪在离体心肌细胞缺血模型中可以明显提高心肌细胞的存活率，具有心脏保护作用，这种保护作用是通过mito KATP调节的。3 讨论

　　20世纪80年代初 Noma[6]首先报道心肌细胞膜存在ATP敏感性钾通道(KATP)，以后的研究证实，该通道也存在于骨骼肌、平滑肌、胰腺β细胞和细胞器(线粒体)，在体内发挥着重要的病理生理作用。心肌细胞膜KATP开放使膜超极化，动作电位时程缩短，Ca2+内流减少，从而舒张血管。近来研究发现KATP开放保护作用的靶点可能位于细胞内，线粒体膜KATP可能是抗心肌缺血药物的新作用靶点。mit KATP开放，膜去极化，K+内流，使线粒体容积增加，促进线粒体呼吸。因而增强组织细胞对缺氧的耐受性，提高机体的内源性抗缺氧能力。

　　尽管二氮嗪具有较强的舒张血管作用，但近来研究发现二氮嗪还是一种高选择性作用于心肌mito KATP的药物，较低浓度的二氮嗪即可开放mito KATP，与开放细胞膜KATP相比，活性强1000余倍。我们曾在整体和离体动物实验中发现二氮嗪对缺血心肌具有保护作用[7,8]，而本研究在细胞水平进一步观察了二氮嗪对缺血心肌细胞的影响，电镜结果发现，预先给予二氮嗪可以减轻ISO皮下注射引起的大鼠心肌细胞损伤。二氮嗪还可降低缺血心肌细胞的死亡率，增加存活率。mito KATP阻断剂5HD可以阻断二氮嗪的保护作用，说明其作用是mito KATP介导的。

　　尽管大量研究显示mito KATP是心脏保护作用的终末效应器，但mito KATP开放是怎样产生保护作用的目前还不十分清楚，有下列几种可能的机制：(1)基质容积增加：线粒体KATP开放，膜去极化，K+内流，线粒体容积增加，可以激活脂肪酸氧化，促进线粒体呼吸和ATP合成;(2)降低线粒体Ca2+超载：线粒体KATP开放，膜电位降低、使Ca2+流入的驱动力下降，可减少Ca2+的摄取;(3)活性氧产生和氧化还原状态：线粒体KATP开放影响线粒体活性氧的产生，活性氧的产生与心脏保护作用有关[9,10]。

　　现有的mito KATP开放剂还缺乏组织特异性，因此研制和开发新型具有mito KATP开放作用的药物将为冠心病提供新的治疗手段。

　　【参考文献】

　　[1]Inoue I, Nagase H, Kishi K, et al. ATPsensitive K+ channel in the mitochondrial inner membrane[J]. Nature, 1991,352:244247.

　　[2]Murata M, Akao M, O'Rourke B, et al. Mitochondrial ATPsensitive potassium channels attenuate matrix Ca2+ overload during simulated ischemia and reperfusion: possible mechanism of cardioprotection[J]. Circ Res， 2001,89:891898.

　　[3]Jahangir A, Ozcan C, Holmuhamedov EL, et al. Increased calcium vulnerability of senescent cardiac mitochondria: protective role for a mitochondrial potassium channel opener[J]. Mech Ageing Dev, 2001,122:10731086.

　　[4]Rona G, Chappel CI, Balazs T, et al. An infarctlike myocardial lesion and other toxic manifestations produced by isoproterenol in the rat[J]. Arch Pathol, 1959,67: 443455.

　　[5]Hayashi H, Miyata H, Noda N,et al. Intracellular Ca2+ concentration and pHi during metabolic inhibition[J]. Am J Physiol, 1992,262(3 Pt 1):C628C634.

　　[6]Noma A. ATPregulated K+ channels in cardiac muscle[J]. Nature, 1983,305:147148.

　　[7]刘 蔚，王浩春，张雁芳，等. 二氮嗪对异丙肾上腺素诱发的大鼠心肌缺血损伤的保护作用[J].中国循环杂志，2002,17:5961.

　　[8]刘 蔚，张雁芳，崔文玉，等.心肌线粒体三磷酸腺苷敏感性钾通道开放剂二氮嗪对体外大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响[J].中华老年心脑血管病杂志，2003,5:347.

　　[9]Costa AD, Quinlan CL, Andrukhiv A,et al. The direct physiological effects of mito KATP opening on heart mitochondria[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol， 2006,290:H406415.

　　[10]Ardehali H. Role of the mitochondrial ATPsensitive K+ channels in cardioprotection[J]. Acta Biochim Pol， 2004,51:379390.