肿瘤坏死因子β基因多态性与慢性肾功能衰竭的关联性研究

　　作者：黄颖 雎天林 秦文斌 　包头医学院内蒙古基因诊断研究所，内蒙古包头014010

　　摘 要 目的：探讨内蒙古包头地区汉族、蒙族人群中肿瘤坏死因子β(tumor necrosis factor beta,TNFβ)1 069位点等位基因多态性与慢性肾功能衰竭的关系。方法：采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对慢性肾功能衰竭患者58例及正常对照85例TNFβ基因的单碱基突变多态性进行了分析。结果：慢性肾功能衰竭患者的TNFβ*2等位基因频率(71.6%)较正常人(55.8%)明显升高(RR=0.504，P< 0.01)。结论：TNFβ*2等位基因频率与慢性肾功能衰竭发病易患性相关。

　　关键词 肿瘤坏死因子β;基因多态性;慢性肾功能衰竭

　　A Study on the Association of TNFβ Polymorphism and Chronic Renal Failure

　　HUANG Ying，JU Tianlin ，QIN Wenbin

　　(Gene Diagnosis Institute of Inner Mongolia , Baotou Medical College，Baotou 014010,China)

　　Abstract Objective：To investigate the relationship between the polymorphism of TNFβ and chronic renal failure among Han and Mongol ethic Chinese in Inner Mongolia autonomous region. Methods：The single base change polymorphism in TNFβ gene was detected among 58 chronic renal failure patients and 85 controls by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP). Results：The gene frequency of the TNFβ*2 (71.6%)was significantly higher in chronic renal failure patients than that in the normal controls (55.8%， RR=0.504，P<0.01).Conclusion：TNFβ*2 allelic frequency is associated with chronic renal failure.

　　Key words Tumor necrosis factorβ;Gene polymorphism; Chronic renal failure

　　慢性肾功能衰竭是各种慢性肾脏疾病未得到彻底治疗、病情持续进展、恶化的晚期综合征。影响慢性肾功能衰竭的因素较多，近年随着慢性肾功能衰竭及其并发症发生机制的研究不断深入，人们注意到炎症反应与肾功能衰竭之间存在诸多联系。目前研究表明慢性肾功能衰竭是一个以细胞因子驱动的，以促氧化过程为特征的慢性炎症状态。炎症反应常出现在大部分慢性肾功衰竭患者的病程中，是血液和透析患者致死的一个极危险因子[1]。TNF是细胞因子网络中的重要组成成分。TNF以其特有的生物活性影响着肾脏疾病的发生、发展及转归。已有研究证明TNF在慢性肾功能衰竭各期中随着肾功能损害加重有逐渐升高趋势，与血肌酐成正相关，提示参与慢性肾功能衰竭的发生、发展，并可作为病情监测、预后的重要指标[2]。肿瘤坏死因子是体内具有多种生物活性的细胞因子，具有抗肿瘤、抗病毒感染、诱发炎症反应、免疫调节以及刺激某些正常细胞生长的作用。编码TNFβ的基因位于人类染色体6p23-q12,HLA-B以及HLA-C位点之间的HLA-Ⅲ抗原决定簇内，3'末端在TNFα基因转录起始点的上游1kb处，总长约3kb，含有4个外显子和3个内含子。近年来研究显示TNFβ基因多态性主要有5种，有文献报道第1内含子内，转录起始点下游第252位点(+252位点，也就是TNFβ基因第1 069位点)处鸟嘌呤(G)-腺嘌呤(A)碱基变化与IgA肾病有关。TNFβ基因第1 069位点为G称为TNFβ*1，具有NcoⅠ限制性内切酶的识别位点;而第1 069位点为A则称为TNFβ*2，没有NcoⅠ限制性内切酶的识别位点。TNFβ基因鸟嘌呤(G)-腺嘌呤(A)突变可调节TNF转录水平[3]，与TNF水平特征性增高有密切关系[4]。TNFβ基因多态性是否与人类自身免疫性疾病、感染、肿瘤等许多疾病相关联，国外学者进行了探讨[5，6]，但结论各不相同。根据TNFβ基因在染色体上的位置及其在慢性炎症中的生物学效应，推测该基因可能与慢性肾功能衰竭的发病机理及临床表现有关。本文采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(ploymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)方法探讨内蒙古包头地区汉、蒙族人群肿瘤坏死因子β(TNFβ)等位基因多态性与慢性肾功能衰竭的相关性。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象 (1)患者组：58例慢性肾功能衰竭患者，其中女性31例，男性27例，年龄7~72年，平均年龄32.09岁,既往无恶性肿瘤病史，近期无手术创伤史及急慢性感染史，无使用免疫抑制剂史。以上患者符合第5版《内科学》(人民卫生出版社2000年)慢性肾功能不全诊断标准。(2)正常对照组：85名健康体检者及献血员，其中女性37例，男性48例，年龄14~71年，平均年龄34.10岁。患者及正常对照组人群均由包头医学院第一附属医院肾内科提供。

　　1.2 仪器和试剂

　　1.2.1 仪器 480型 PCR扩增仪(美国PE公司);TGL-B16型高速离心机(上海安亭厂);电泳仪(北京若比邻公司);紫外线灯(北京若比邻公司);KH-UVⅢ紫外透射自动成像分析仪(上海康禾光电仪器有限公司)。

　　1.2.2 试剂 裂解液(包头医学院基因诊断研究所);Taq DNA 聚合酶(上海生工生物工程有限公司);限制性内切酶NcoⅠ(上海生工生物工程有限公司);DNA分子量标准Marker(包头医学院基因诊断研究所)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 基因组DNA的抽提 取静脉血2ml，加入EDTA-K+或3.8%枸橼酸钠1/5体积(400μl)抗凝，冻存。将冻存的血液解冻后，取50μl 放入1ml 的EP管中，加双蒸水至1ml左右，用微量移液器将EP管中的液体混匀。将EP管放在室温下15min(严格)，之后在转速2 000～3 000 r/min的低速离心机，离心1min ，弃掉上清液留约50μl的沉淀(在沉淀上可以有少许液体)。再在EP管中加裂解液60μl，置于震荡器上震荡1min后 ，将EP管放在温度为56～60℃的水浴中30～40min 。再将EP管放在沸水锅中煮10min，用纸擦干管帽后立即放在流水中冷却，再用纸擦干置于震荡器上震荡1min。最后将EP管放在转速11 500 r/min的高速离心机，离心4min，上清液中即含有DNA模板。

　　1.3.2 聚合酶链反应(PCR) (1)引物：TNFβ基因第1 069位点特异性引物(由上海生物工程有限公司合成)按报道[4]设计。正引物pN(F)： 5'-CCGTGCTTCGTGCTTTGGACTA-3' ,负引物pN(R)： 5'-AGACGTTCAGGTGGTGTCA-3' ，对应产物为TNFβ基因第1、2外显子的427bp的基因片段。(2)反应体系：每个PCR扩增体系为13μl。其中包括：10×buffer 1.25μl，pN(F) 0.175μl ，pN(R) 0.175μl，dNTP 0.25μl (浓度为10μmol/L)，Taq酶SG 0.05μl (5U/μl)，注射用水9.6μl，模板(基因组DNA)1.5μl，石蜡1滴。(3)扩增条件(PCR循环参数设置)：预变性93℃ 2min，变性93℃ 30s，退火64℃ 35 s，延伸72℃ 40 s，共35循环。继后终末延伸72℃ 5 min，终止扩增。

　　1.3.3 产物鉴定及分析 (1)酶切(基础实验RFLP酶切系统)：每个酶切体系为22μl。其中包括：PCR扩增反应产物12μl，10×Buffer 2μl，NcoⅠ0.5μl(10U/μl)，Acetyl BSA(乙酰化牛血清白蛋白)0.2μl，H2O 7.3μl。混匀，37 ℃水浴4 h。(2)电泳(琼脂糖3.0g/dl凝胶电泳)：制胶，取0.3g琼脂糖凝胶放在三角烧杯中，加1×TEB缓冲液至20ml ，混匀，置于电炉上加热，当胶完全溶解后加入溴化乙锭(0.5mg/l)10μl ，混匀，趁热浇注在电泳板上。电泳，每管中加4μl溴酚蓝，取13μl 扩增产物加入点样孔中，电泳15～60 min (U=100V)。观察结果，将整个电泳板置于紫外灯下观察，用自动成像分析仪记录分析结果。

　　1.3.4 数据处理 TNFβ基因频率及基因型频率用直接记数法，采用χ2 检验进行Hardy-Weinberg平衡吻合度检验，组间比较χ2 检验。不同人种TNFβ基因频率的构成比用χ2 检验进行比较，用Woolf公式计算相对危险度(relative risk, RR)大小及95%可信区间(95% confidence interval, 95%CI)，所有数据统计由SPSS13.0统计软件包完成。

　　2 结果

　　2.1 TNFβ基因频率及等位基因频率 用3'5'TNFβ引物进行PCR扩增反应可获得第1外显子到第2外显子长度为427bp的一段基因片段扩增产物，经限制性内切酶NcoⅠ作用后(酶切位点为1 064与1 065之间的碳碳三键)，根据基因不同，产生3种酶切结果：(1)TNFβ*1/1纯合子，扩增的基因片段含有NcoⅠ的酶切位点，可被完全酶切为231bp 、196bp两条带;(2)TNFβ*1/2杂合子，产生不完全酶切，出现427bp、231bp、196bp三条带;(3)TNFβ*2/2纯合子，扩增的基因片段没有NcoⅠ的酶切位点，不能酶切，则只出现427bp一条带。其酶切结果见图1。

　　图1 TNFβ基因酶切产物3%琼脂糖凝胶电泳结果　略

　　2.2 慢性肾功能衰竭患者与正常对照组TNFβ等位基因频率及基因表型分布 应用Hardy-Weinberg定律进行检验，两个群体都达到了遗传平衡(P>0.01)。慢性肾功能衰竭TNFβ*2等位基因频率显著高于正常人群(P< 0.01),提示TNFβ*2等位基因与慢性肾功能衰竭的发病有关。详见表1。

　　表1 TNFβ基因型及等位基因频率在慢性肾功能衰竭及健康对照组中的比较研究(略)

　　3 讨论

　　本研究结果显示：内蒙古包头地区汉、蒙族慢性肾功能衰竭患者的TNFβ*2等位基因频率显著高于正常人群，而TNFβ*1等位基因频率较正常人群低，提示TNFβ*2基因多态性与慢性肾功能衰竭的发病有关。免疫反应的肾脏损害在慢性肾功能衰竭的发生、发展中起很重要的作用。免疫反应激活炎症细胞，使之释放炎症介质造成肾小球损害。TNFβ是其中起主要作用的炎性细胞因子。TNF与免疫炎症和免疫调节有关，有研究显示它可能参与IgA肾病发病[7]。Lee[8] 等曾经报道TNFβ两个等位基因之间不仅存在着结构上，还存在着功能上的差异，体外植物血凝素诱导外周血单个核细胞分泌TNFβ，提示TNFβ*1纯合子产生TNFβ的水平高于TNFβ*2纯合子。鉴于TNFβ在免疫反应中所起的作用，结合本研究显示慢性肾功能衰竭患者中TNFβ*2纯合子的检出率显著高于正常对照，提示TNFβ基因多态性可能影响慢性肾功能衰竭的易患性，参与不同肾脏病变的发生发展过程，TNFβ*2等位基因可作为内蒙古包头地区汉、蒙族慢性肾功能衰竭的发病易患基因的一个标记。TNFβ位于MHCⅢ抗原基因簇内与MHCⅠ、Ⅱ类抗原基因相邻，TNFβ基因与HLA的某些单倍体有连锁不平衡，而MHC复合体具有高度多态性。故由NCOⅠ定义的TNFβ等位基因，其结构和诱导水平上的差异，可能与MHC相关的疾病的易感性有关。

　　HLA其它基因的基因多态性亦可影响TNFβ活性，因此TNFβ基因多态性在各种病因引起的慢性肾功衰竭疾病中的地位还不明确，TNFβ基因多态性在这些疾病的发生、发展中是起主要作用还是协同作用，有待于进一步讨论和研究。

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