BAG-1蛋白在非小细胞肺癌中的表达及其与预后关系的研究

　　作者：吴倩，朱志图，哈敏文 作者单位：辽宁医学院附属第一医院肿瘤科， 辽宁 锦州

　　【摘要】 目的 研究 BAG-1 蛋白在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC)中的表达及其与患者临床特征和预后的关系。方法 应用免疫组化的方法检测 125 例 NSCLC 术后石蜡标本中 BAG-1 蛋白的表达情况，随访后进行生存预后分析。同时选择 10 例肺炎性假瘤作对照组观察其表达情况。结果 ① BAG-1 蛋白在 NSCLC 组织中存在高表达(阳性率为 64.8 %);② BAG-1 蛋白表达水平与组织学分级相关，分级越差，其阳性表达率越高(P = 0.031);③多因素Cox 风险模型分析 BAG-1 是独立的预后因素;④ BAG-1 蛋白阳性患者具有生存优势(P = 0.044)，且 BAG-1 在胞浆中的表达具有更低的死亡风险(P = 0.039)，BAG-1 蛋白表达阳性组患者的中位生存时间及 5 年生存率均高于阴性表达组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 BAG-1 蛋白是 NSCLC 独立的预后因素且其表达与预后相关，可能成为新型的临床预后指标。

　　【关键词】 BAG-1;非小细胞肺癌;预后

　　Correlation Between the Expression of BAG-1 and Prognostic

　　Significance in Non-small Cell Lung CancerWU Qian, ZHU Zhitu, HA Minwen

　　(Department of Oncology, the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001 China)Abstract：Objective To detect the correlation between the expression of BAG-1 and prognostic significance in non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods The expression of BAG-1 is measured by immunohistochemistry in paraffin sections of 125 NSCLC postoperative patients , then we analyze the existence and prognosis . At the same time, select 10 patients with pulmonary inflammatory pseudotumor as control group to observe the expression. Results (1)BAG-1 protein stands high expression in NSCLC (positive rate 64.8%).(2)The expression levels of BAG-1 correlates with cell splitting. The lower the splitting, the higher the rate of positive expression(P= 0.031).(3)Cox multifactors model analysis indicates that BAG-1 acts as an independent prognostic factor in NSCLC.(4)Sufferers with BAG-1 positive expression have the survival advantage(P=0.044). In addition, patients whose tumor exhibits cytoplasmic staining have a further reduction of the risk of death (P=0.039). The median survival time and 5-year survival rates in patients with positive BAG-1 protein expression is higher than that in patients with negative BAG-1 protein expression. The difference has a statistic significance(P<0.05). Conclusions BAG-1 is an independent prognostic factors and correlated with their expression and prognosis in NSCLC. It may become a new indicator of prognosis.

　　Key words:BAG-1;NSCLC;prognosis

　　肺癌是全球发病率和死亡率最高的肿瘤，且一直呈上升趋势，其中约 80 %为 NSCLC。细胞凋亡缺陷或受阻是肺癌发生发展的重要原因[1]，但其机制复杂，涉及很多基因和蛋白。研究发现，BAG-1 ( BCL-2 Associated athanogene 1)是多功能相关蛋白，与多种基因蛋白产物相互作用来调节细胞的凋亡和增殖。其在正常组织中不表达或弱表达，而在乳腺癌、大肠癌、肺癌等恶性肿瘤中都有表达, 且在不同肿瘤中的意义也不尽相同[2]，与预后的关系也尚未明确。因此肿瘤细胞中BAG-1 蛋白的表达与其临床意义方面的研究已成为目前研究的热点之一。为进一步探讨 BAG-1 蛋白在 NSCLC 中的表达及意义，我们应用免疫组织化学方法检测 125 例 NSCLC 标本中 BAG-1 蛋白的表达，并分析其与临床特征和预后的关系。

　　1 资料和方法

　　1.1 研究对象一般资料

　　本实验所有研究对象为 2000 年 1 月至2004 年 1 月在辽宁医学院附属第一医院胸外科手术治疗后经两名资深的病理医生明确诊断为 NSCLC 的患者125 例。其中男性 69 例，女性 56 例，年龄范围 31～79 岁，中位年龄 54 岁。其中腺癌 70 例(高-中分化 42 例、低分化 28 例)、鳞癌 55 例(高-中分化37 例、低分化 18 例);Ⅰ期 70 例、Ⅱ期 23 例、Ⅲ期 32 例(AJCC 2002 年分期标准);有转移者 58 例、无转移者 67 例;另取 10 例肺炎性假瘤标本作对照组。所有标本均经 10 % 福尔马林固定，常规石蜡包埋后存档。

　　1.2 随访和评价指标

　　所有患者均采用电话或者门诊随访的方式。随访时间为从患者手术后到 2008 年 5 月 26 日或由于复发、转移及其他原因死亡的日期。所有患者平均随访 6.4 年，中位随访时间为 63 个月。随访时重新行胸部 CT 等检查，所有病例均有完整的随访资料。评价指标：总生存期(overall survival，OS);中位生存期 (median survival time，MST);生存率(survival rate，S)。OS：定义为患者手术的日期至由于复发、转移及其他原因死亡的日期或最后一次随访的日期。MST：指生存率为 50 % 时对应的生存时间。S：指观察对象活过 tk 时刻的概率。

　　1.3 实验材料和方法

　　1.3.1 免疫组化试剂

　　兔抗人BAG-1多克隆抗体 (克隆号：C-16 产品号：SC - 939 工作浓度1：150 santa cruz公司产品)、即用型 PV 二步法(PV - 9000)免疫组化试剂盒、浓缩型 DAB试剂盒、磷酸盐缓冲液PBS (0.01 M，pH 7.2～7.4)、柠檬酸抗原修复液(0.01 M，pH 6.0)。以上试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.3.2 免疫组化染色

　　本实验所有患者组织切片均应用免疫组化 PV 二步法。用已知的 BAG-1 蛋白阳性片做阳性对照，用 PBS 代替一抗作阴性对照。实验步骤严格按试剂盒说明书进行。

　　1.3.3 结果判定

　　观察结果采用双盲法。用 Greenspan 半定量法对阳性细胞百分率及细胞染色强度进行评分：每张切片在 5 ～10 个高倍镜视野下进行细胞记数，每个视野记数100 ～ 200 个细胞，共 1 000 个细胞，计算出每张切片阳性细胞数所占的比例。以定位明确的阳性表达细胞 < 25 % 为 1 分，25% ～50 % (包括 25 %) 为 2 分，50 % ～ 75 % (包括 50 %) 为 3 分，≥ 75 % 为 4 分;以阳性细胞染色深度出现淡黄色为 1 分，黄色为 2 分，棕黄色为 3 分;将每一标本两项得分相乘得出总分 0～4 分记为-，5～8分记为 +，9 ～ 12 分记为 ++ 。所有切片均有2名观察员进行观察评分。

　　1.4 统计学分析

　　应用SPSS16.0软件处理数据。用 χ2 检验进行两个样本率的比较，Kaplan-Meier 方法进行生存分析，用 Log-rank test 进行生存曲线分析，用 Life-table 法进行生存率的计算，用 Cox 风险模型进行预后因素分析。检验水准确定P< 0.05为有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 BAG-1 蛋白表达情况

　　BAG-1蛋白主要在细胞核和(或)细胞浆表达，125例NSCLC术后患者BAG-1蛋白表达阳性81例，阳性率为64.8 %(44 / 81)，10例肺炎性假瘤BAG-1蛋白表达阳性1例，阳性率为10 % (1/10)，差异有统计学意义(P= 0.001)。BAG-1蛋白表达分为胞浆和胞核、胞浆、胞核表达三种，BAG-1蛋白在胞浆中阳性表达率越高，患者死亡风险越低，生存时间越长(P= 0.039)(见图1～5)。

　　2.2 BAG-1 蛋白表达与临床病理特征之间的关系

　　BAG-1 蛋白表达水平与组织学分级相关，组织学分级越高其阳性表达率越高(P= 0.031)，与患者的性别、年龄、病理类型、分期及淋巴结转移差异无统计学意义 ( 见表1 )。

　　2.3 多因素Cox 风险模型分析

　　多因素Cox 风险模型分析表明，BAG-1、分期及组织学分级均是独立的预后因素，P值分别为0.021、0.015、0.025(见表2)。

　　2.4 各组间不同BAG-1蛋白表达的生存分析

　　Log-rank 生存分析表明：BAG-1 蛋白表达阴性、阳性时的 OS 差异均有统计学意义(P= 0.044)，BAG-1 蛋白表达阴性时 NSCLC 预后较差。Life-table结果分析：BAG-1 蛋白阴性表达组的 44 例患者的 MST 为 37.5 月，5 年生存率为 29.5 %(13 / 44);而 BAG-1 蛋白阳性组的 81 例患者中 MST 为 49.3月，5 年生存率为 38.3 % ( 31 / 81)，差异均具有统计学意义(P<0.05)，(见图6)。表1 BAG-1蛋白的表达与NSCLC临床特征之间的关系临床参数BAG-1 蛋白表达总数-+χ2P性别男性 表2 NSCLC患者的 Cox 多因素生存分析模型变量VFHRwaldP-Value年龄

　　3 讨 论

　　BAG-1基因是Takayama等人[3]于1995年在对人淋巴细胞株Jurkat筛检与BCL-2蛋白相结合的蛋白时发现的，BAG-1蛋白为多功能结合蛋白，系抗凋亡基因，可与多种信号因子(BCL-2、HSP70、RAF等)相互作用，发挥细胞凋亡、信号传导、细胞增殖、基因转录及细胞运动等调节通路。由BAG-1调节的途径在肿瘤的发生和发展过程中起重要作用，与肿瘤形成和化疗耐药相关[4]。为作为多种肿瘤的新型临床预后指标和治疗靶点提供了可能。

　　目前，BAG-1蛋白在肺癌中的表达及其与预后的关系尚存在争议。Rorke等[5]应用免疫组化的方法观察了85例非小细胞肺癌患者肿瘤组织中BAG-1蛋白表达情况，结果表明，BAG-1蛋白表达的强度和亚细胞分布与总生存期呈正相关。BAG-1蛋白在胞浆中阳性表达率越高,患者死亡风险越低，且其表达水平与患者的年龄、肿瘤分期及组织学类型无关。Cox 风险模型分析表明，这些患者BAG-1蛋白过度表达显著降低死亡危险 (HR = 0.53，P值0.03)。Kaplan-Meier 和Log-rank test 分析显示，BAG-1蛋白过表达的患者具有生存优势(MST为30.10个月对17.04个月，P值0.05 )。而刘红雨等人[6]应用Real-time PCR检测肺癌患者组织中BAG-1基因表达情况得出：BAG-1低表达组患者生存预后较好，BAG-1高表达可能与患者的不良预后相关。本实验研究通过对125例术后的NSCLC患者组织标本进行免疫组化染色，随访结果分析得出结论：BAG-1蛋白表达与预后相关，BAG-1蛋白阳性者存在生存优势，且胞浆表达具有更低的死亡风险(P< 0.05);BAG-1蛋白表达阳性者其中位生存期较阴性者明显延长(MST 49.3月对MST 37.5月，P< 0.05)，其5年生存率也明显高于阴性组(38.3 % 对29.5 %，P< 0.05)，表明BAG-1蛋白表达的强度和亚细胞分布与总生存期呈正相关;多因素Cox风险模型分析中BAG-1蛋白为有独立预后意义的指标，HR = 0.513、P= 0.021，阴性者的死亡风险显著增加。

　　BAG-1基因根据翻译起始位点的不同主要编码4种不同的异构蛋白，分别为BAG-1S、BAG-1L、BAG-1M及P29，BAG-1S主要定位于胞浆，由此推断BAG-1S含量高者可能生存预后较好。BAG-1是抗凋亡基因，理论上蛋白高表达患者生存预后较差，而研究的结论恰恰相反，这似乎存在矛盾。一种可能是癌细胞株在体内的建立，抗凋亡活动的存在确实是对患者有益，至少在NSCLC的研究中直接证明了这个问题。Tormanen U等人[7]在一个75 例NSCLC回顾性研究表明，那些增加凋亡指数的患者死亡风险增加1.9倍。这个表面上凋亡活动和生存之间的自相矛盾的关系在 BCL-2的抗凋亡活动中同样存在[8]。合理的理论建立在细胞生长和细胞增殖之间平衡的基础上，而不清楚的是抗凋亡活动是如何改善患者生存的，这需要进一步的研究。

　　肺癌个体化治疗是目前研究的热点，研究肿瘤发生发展过程中敏感特异性的基因，为进行前瞻性地 NSCLC 分子指标的测定及指导临床工作提供依据。BAG-1 基因分泌的多功能蛋白通过多种途径发挥抗凋亡作用，某些具体机制还不是很清楚，且目前的一些研究结果存在矛盾，如果要充分了解 BAG-1 基因以及其各种亚型肿瘤发生、发展中所扮演的角色，以及 BAG-1 是否能够成为肺癌的诊断、判断预后指标和治疗靶点，我们还需要更多细致的研究。

　　【参考文献】

　　[1] Sharma SV, Bell DW, Settleman J, et al. Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2007,7:169-181.

　　[2] Nadler Y, Camp RL, Giltnane JM, et al. Expression patterns and prognostic value of Bag-1 and Bcl-2 in breast cancer[J]. Breast Cancer Res, 2008,10:R35.

　　[3] Takayama S, Sato T, Krajewski S, et al. Cloning and functional analysis of BAG-1: a novel Bcl-2-binding protein with anti-cell death activity[J]. Cell, 1995,80:279-284.

　　[4] Dobbyn HC, Hill K, Hamilton TL, et al. Regulation of BAG-1 IRES-mediated translation following chemotoxic stress[J]. Oncogene, 2008,27:1167-1174.

　　[5] Rorke S, Murphy S, Khalifa M, et al. Prognostic significance of BAG-1 expression in nonsmall cell lung cancer[J]. Int J Cancer, 2001,95:317-322.

　　[6] 刘红雨,白云,刘宝兴,等. BAG-1基因在肺癌中的表达及其与预后关系的分析[J].中国肺癌杂志，2008,11:489-494.

　　[7] Tormanen U, Eerola AK, Rainio P, et al. Enhanced apoptosis predicts shortened survival in non-small cell lung carcinoma[J]. Cancer Res, 1995,55:5595-5602.

　　[8] Dzhagalov I, Dunkle A, He YW. The anti-apoptotic Bcl-2 family member mcl-1 promotes T lymphocyte survival at multiple stages[J]. J Immunol, 2008,181:521-528.