As2O3联合DDP对裸鼠乳腺癌移植瘤作用的研究

　　作者：张卓 作者单位：峰峰集团总医院CT室，河北邯郸056200

　　【摘要】 目的 探讨三氧化二砷(As2O3)和顺铂(DDP)联合应用对人乳腺癌细胞系MCF-7裸鼠移植瘤生长的抑制作用并探讨其机制。方法 建立MCF-7乳腺癌裸鼠移植瘤模型。随机分为4组：对照组、As2O3组、DDP组、As2O3+DDP组(联合组)。分别测量裸鼠体质量、瘤质量及瘤体积，透射电镜观察各组移植瘤组织的超微结构，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤组织中Survivin mRNA的表达。结果 在瘤质量及瘤体积方面，联合组与As2O3组、DDP组比较显著减小。电镜下联合组肿瘤细胞内可见典型的凋亡表现：核碎裂，染色质浓缩、边集。RT-PCR结果显示：联合组与As2O3组、DDP组比较Survivin mRNA条带强度显著减小。结论 As2O3与DDP联合应用对MCF-7裸鼠移植瘤生长有明显的抑制作用,其作用机制可能与下调Survivin有关。

　　【关键词】 三氧化二砷 顺 乳腺癌细胞 移植瘤

　　Combined application of arsenic trioxide and cisplatin inhibits

　　xenografted MCF-7 tumors in nude mice

　　ZHANG Zhuo1， LI Haixin2, LIU Tao1

　　(1. CT Room, General Hospital of Feng-Feng Group, Handan, Hebei 056200, China;

　　2. Department of Clinical Laboratory, Handan Central Hospital, Handan, Hebei 056001)

　　Abstract:Objective To study the effect of arsenic trioxide (As2O3) and cisplatin (DDP) on human breast cancer cell line MCF-7 in vivo and its possible mechanism of action.Methods MCF-7 cells were xenografted in BALB/C nude mice, and the tumor-bearing mice were divided into a control group and three drug test groups (to be treated with As2O3, DDP or their combination). The tumor volume and mass were compared by the end of the therapy time. Transmission electron microscopy was made to study the cellular ultrastructure of tumor. RT-PCR was used to detect the Survivin gene.Results The tumor mass and volume were decreased in the test groups, more markedly in the combined drug group than in the other two test groups. The nuclear chromatin was found condensed, marginated and segregated in the combination group, not in the other two test groups. The expression of Survivin mRNA in the combination group was markedly lower than in the other groups.Conclusion The combination of arsenic trioxide and DPP can significantly inhibit tumor growth in nude mice bearing human breast cancer cell line MCF-7, which may be related to the down-regulation of Survivin expression.

　　Key words: arsenic trioxide; cisplatin; breast cancer cell; xenograft

　　三氧化二砷(As2O3)是传统中药砒霜的主要成分，口服的剧毒性及各种毒性反应极大地限制了其临床应用。近年来研究发现As2O3不仅对急性早幼粒细胞白血病(APL)有治疗效果，对其他类型的白血病以及许多实体恶性肿瘤，如肝癌、肺癌、胃癌等都有良好的治疗效果。陈鑫等[1]研究证实，As2O3对人乳腺浸润性导管癌裸鼠移植瘤有抑制作用。本研究利用裸鼠荷人MCF-7乳腺癌动物模型，研究As2O3和顺铂(DDP)联合应用对人乳腺癌细胞系MCF-7裸鼠移植瘤生长的抑制作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 药物和细胞株 As2O3(1 g/L)购于河北医科大学附属第二医院(哈尔滨伊达药业有限公司产品)，批号20001105;DDP(1 g/L)为山东省德州制药厂产品，批号055578。乳腺癌MCF-7细胞株购于武汉大学中国典型培养保藏中心。

　　1.2 裸鼠移植瘤模型的建立 对数生长期的细胞消化后调整为2×1012/L悬液，每只0.2 ml注射于裸鼠右前肢腋下，观察肿瘤移植成功率。

　　1.3 实验分组 实验动物为BALB/C遗传背景的裸鼠，购于北京协和医科大学实验动物中心。选用4～6周龄,体重18～20 g的雌性裸鼠。24只裸鼠饲养于恒温(22～25℃)、恒定湿度的SPF层流罩中，随机分为4组，每组6只。经高压灭菌的标准饲料和水供动物自由饮食。接种MCF-7细胞后第15天开始用药，此时移植瘤大小约75 mm3，各组之间无显著差异。每次用药前称裸鼠体质量。用药情况如下：①对照组：生理盐水，0.2 ml/次，隔日腹腔注射1次，共8次。②As2O3组：As2O3 3.0 mg/kg，0.2 ml/次，隔日腹腔注射1次，共8次。③DDP组：DDP 3.0 mg/kg，0.2 ml/次，每周腹腔注射2次，共4次。④As2O3+DDP组(联合组)：As2O3 1.5 mg/kg，0.2 ml/次，隔日腹腔注射1次，共8次;DDP 1.5 mg/kg，0.2 ml/次，每周腹腔注射2次，共4次。

　　1.4 皮下肿瘤生长治疗实验 用药前测量移植瘤体积，实验结束时测量移植瘤质量及体积。同时于用药前及治疗结束时称裸鼠体质量(裸鼠质量=带瘤鼠质量-瘤质量)。按公式[2]计算移植瘤体积(T)：T=πAB2/6(π：圆周率，A：最长径，B：最短径)。按公式[3]计算抑瘤率及q值：抑瘤率=(1-治疗组平均瘤质量/对照组平均瘤质量)×100%;q值=联合组抑瘤率/[As2O3组抑瘤率+DDP组抑瘤率×(1-As2O3组抑瘤率)]。根据q值判断联合用药的疗效，若<0.85为拮抗，若0.85～1.15为相加，若>1.15为协同。

　　1.5 透射电镜观察 从剥离的瘤体上取下小块组织用眼科剪剪成2 mm×2 mm,戊二醛前固定，锇酸后固定2 h,常规脱水包埋切片,铅铀染色透射电镜观察,拍照。

　　1.6 RT-PCR测定Survivin mRNA的表达 按常规方法进行组织总RNA的提取、cDNA的合成。PCR反应：反应总体积为20 μl，包括4 μl cDNA，25 mmol/L MgCl2 1.5 μl，0.5 U Taq酶 1 μl，10 μmol/L引物各0.7 μl，10 mmol/L dNTP 0.4 μl，10×buffer 0.8 μl，用超纯水补足到20 μl。PCR反应条件为：94℃预变性5 min，94℃30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环，72℃复性5 min。引物由北京奥科生物技术公司设计合成。Survivin引物序列上游：5′-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CT- 3′;下游:5′-GAC AGA AAG GAA AGC GCA ACC-3′(229 bp);β-actin上游: 5′-GAC AGG CAG AAG GAG ATT ACT G-3′;下游:5′-GCT GAT CCA CAT CTG CTG GAA-3′(142 bp)。PCR产物经8%聚丙烯酰氨凝胶电泳，溴化乙啶(EB)显色，Bio-profif 凝胶图像分析系统进行摄像分析。通过Survivin/β-actin的灰度比值作相对定量。

　　1.7 统计学处理 计量资料数据以±s表示;应用SPSS12.0软件包进行统计学分析，采用单因素方差分析和t检验。

　　2 结 果

　　2.1 裸鼠体内成瘤情况 自接种后第3天可见接种部位小结节，随后结节逐渐长大，至第14天达6 mm×5 mm大小。24只裸鼠全部成瘤，成瘤率达100%。

　　2.2 各组副作用比较及治疗前后裸鼠体质量变化 整个治疗过程中，未发现裸鼠有明显的惊恐、不安或拒食现象，各组裸鼠活动良好，DDP组及联合组裸鼠体质量有轻度下降(考虑主要为DDP的毒副作用)。各组治疗前后裸鼠体质量的变化及各组之间差异均无显著性(表1)。表1 各组治疗前后裸鼠体质量变化

　　2.3 各组平均瘤质量及瘤体积 从平均瘤质量及瘤体积来看，各用药组瘤质量及瘤体积明显低于对照组，联合组和其他2组比较有显著性差异(表2)。

　　2.4 移植瘤组织的超微结构观察 经联合治疗后,取肿瘤组织在透射电镜下观察发现细胞存在核碎裂，染色质浓缩、边集等典型的凋亡形态学改变(图1A)。而As2O3组和DDP组则无上述典型表现：胞质内较多粗面内质网，并有脱颗粒现象;囊池有不同程度的扩张;线粒体有不同程度的肿胀、空泡变，部分嵴融合消失(图1B、1C)。 表2 各组平均瘤质量及瘤体积

　　2.5 Survivin mRNA表达情况 由RT-PCR的聚丙烯酰氨凝胶电泳图(图2)可以观察到，As2O3组、DDP组和联合组的Survivin mRNA条带强度较对照组减弱(Survivin/β-actin比值依次为0.485±0.105、0.527±0.134、0.202±0.107)，并明显低于对照组(0.852±0.174)。

　　3 讨 论

　　乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，约占全身恶性肿瘤的7%～10%，全世界每年新发乳腺癌约150万例，死亡57万例，而且发病率目前有增高趋势，有可能超过宫颈癌而居女性恶性肿瘤的首位[4]。目前，已明确As2O3与DDP为毒副作用不尽相同的两类药物，但对两者减量联合应用是否可以不影响疗效又能降低毒副作用的研究甚少。为此，我们将As2O3与DDP联合应用于人乳腺癌细胞系MCF-7裸鼠移植瘤，为As2O3在乳腺癌临床化疗中的应用提供依据。

　　本实验观察了As2O3与DDP联合用药的抗肿瘤效果。结果表明，As2O3及DDP均有较好的抑制人乳腺癌细胞系MCF-7裸鼠移植瘤生长的作用，移植瘤质量及体积显著低于阴性对照组(P<0.01)。联合应用对人乳腺癌细胞系MCF-7裸鼠移植瘤生长有更为明显的抑制作用，裸鼠移植瘤质量及体积显著低于As2O3及DDP单药治疗组(P<0.01)，q值为0.96，表明As2O3与DDP联合应用抗肿瘤具有相加作用。其可能机制是：As2O3与DDP二者相互增强其杀伤肿瘤细胞的能力;As2O3与DDP二者相互降低肿瘤细胞对它们的抵抗性或耐受性。在本实验的整个过程中，联合用药组裸鼠活动情况良好，与As2O3及DDP单药治疗组比较裸鼠体质量均无明显改变。表明联合用药不仅增加了疗效，而且未增加药物的毒副作用。

　　电镜下凋亡的特征是联合组肿瘤细胞内可见胞质浓缩，核碎裂，染色质浓缩、边集。而As2O3组和DDP组则仅见胞质内较多粗面内质网，并有脱颗粒现象;囊池有不同程度的扩张;线粒体有不同程度的肿胀、空泡变，部分嵴融合消失。显示联合用药促进凋亡的效果高于单独用药。

　　人乳腺癌MCF-7裸鼠移植瘤经As2O3和DDP处理后，Survivin表达：联合组与As2O3组和DDP组比较有显著差异(P<0.01)，而As2O3组和DDP组比较无显著差异(P>0.05)。结果表明，As2O3与DDP可使移植瘤Survivin基因mRNA表达水平下调，这可能是As2O3和DDP诱导人乳腺癌细胞移植瘤细胞凋亡的分子机制之一，即通过介导Survivin的表达下调而使细胞凋亡。

　　本研究认为As2O3与DDP联合应用不仅对乳腺癌有明显的抑制作用，且As2O3与DDP低浓度既可克服或减小乳腺癌细胞的药物耐受，还能减少化疗药物的毒副作用。

　　【参考文献】

　　[1] 陈 鑫,吴诚义.三氧化二砷对人乳腺癌裸鼠移植瘤的作用[J].中华实验外科杂志,2003,20(8):722-723.

　　[2] Hahnfeldt P, Panigrahy D, Folkman J, et al. Tumor development under angiogenic signaling: a dynamical theory of tumor growth, treatment response, and postvascular dormancy[J]. Cancer Res, 1999,59(19): 4770-4775.

　　[3] 夏景林,杨秉辉,叶胜龙,等. TNP-470和丝裂霉素联用对肝癌生长和转移抑制作用的实验研究[J].癌症,2000,19(4):341-343.

　　[4] 宋进华.乳腺癌的基因治疗与核素靶向治疗[J].国外医学·放射医学核医学分册,2003,27(6):241-244.