原子力显微镜对星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤的鉴别诊断

　　作者：张佳怡 纪小龙 王美娥 作者单位：辽宁医学院研究生院，辽宁 锦州 121001

　　【摘要】 目的 通过原子力显微镜(AFM)观察星形细胞瘤(II/WHO) 细胞、间变性星形细胞瘤(III/WHO)细胞的细胞膜表面超微结构的变化和差异，为临床的星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤鉴别诊断提供帮助和向导。方法 选取星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤各30例，每例随机选取10个细胞作为研究对象，应用AFM并对每例的10个细胞进行扫描，对每个细胞膜表面1 μm区域的平均粗糙度、峰值、表面积差值进行测量，对比观察两组细胞膜表面的纳米结构变化、找出肿瘤细胞特异性的形态学特征。结果 通过观察发现星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤的细胞膜表面存在着显著的差异，星形细胞瘤细胞膜表面的平均粗糙度、峰值、表面积差值均明显低于间变性星形细胞瘤(P<0.05)。结论 本实验应用AFM对星形细胞瘤细胞、间变性星形细胞瘤细胞进行观察，并依据细胞膜表面数据对星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤进行鉴别诊断。

　　【关键词】 原子力显微镜 星形细胞瘤 间变性星形细胞瘤 膜蛋白

　　原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)[1]是具有原子级分辨率的新一代显微镜，可以在常规生理环境中清晰呈现出细胞膜表面的超微结构并进行数据分析。AFM的出现对膜蛋白结构的认识提供了更广的空间，蛋白质分子在脂质上有规律地排列或者能在膜上形成二维晶体，均适合于应用AFM研究[2，3]，使人们对生命的认识开始深入到了纳米级水平上的超微观领域。

　　现代医学研究表明[4-6]：肿瘤细胞膜表面受体蛋白与细胞外部生长因子(或其它刺激因素)结合后的跨膜信号转导在肿瘤的发生中起着重要作用。细胞外部信号无论是作用于细胞核内还是核外，它们的传递都必须经由细胞膜，并与细胞膜表面的特异性受体(蛋白)结合，然后传递至细胞内而发挥作用。一旦细胞表面受体蛋白的结构与功能出现异常，则其持续的激活状态将导致细胞增殖失控，从而促进肿瘤的发生。肿瘤细胞的生长过程必然伴有细胞膜表面蛋白(数量和形态)的改变。采用AFM对星形细胞瘤细胞和间变性星形细胞瘤细胞进行观察，研究二者细胞膜表面超微结构的差异，为其临床的鉴别诊断提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料和设备

　　标本全部经HE染色确定为星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤的新鲜组织细胞，来源于武警总医院。各30例;2%甲醛溶液、苏木素—伊红染液、巴氏染液、酒精、二甲苯。主要设备：原子力显微镜 (型号为Nanoscope Ⅲa(Digital Instruments Inc.,Santa Barbara,CA)，采用NSC—11型针尖;Olympus BX50光学显微镜;显微图像分析系统;超净工作台;离心机、漩涡混合器。

　　1.2 方法

　　1.2.1 分别用刮板在收集到的星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤组织上进行取样，并将采集了瘤细胞的刮板放入装有2%甲醛溶液的试管中，在试管上做好标记，摇荡刮板使细胞标本洗脱在溶液中，去除刮板后固定20 min，用200目钢网过滤，去除组织残块和细胞团，放入离心机，1 500 r/min离心15 min，缓缓倾去上清液，再用2%甲醛溶液洗涤、离心、弃上清液反复3次，加少许2%甲醛溶液将沉淀的细胞用漩涡混匀器混匀，将细胞悬液涂于洁净的载玻片上，置于洁净空间晾干备用。

　　1.2.2 AFM观测 将样本晾干后置于AFM载物台上，利用Nikon倒置显微镜观察细胞的分散情况，选择细胞分散较好的区域进行扫描。最大扫描范围100 μm，用200 μm长的Si3N4微悬臂，采用轻敲模式(Tapping mode),图像采集为恒力模式(Height mode)。调整激光与针尖重合，并将探测器的激光光斑置于中心圆点。在操作软件下进行自动调频，然后下降探针，直至针尖接触到样本，开始扫描。此时计算机显示该细胞相应的图像，此图像可以进行测量和保存。每例样本扫描10个细胞，扫描范围为500 nm～100 μm,扫描频率为0.5～2 Hz。选细胞膜表面颜色最亮、突起最大最密集的区域测量，所选细胞测量范围均为1 μm，每一组各测量300个区域。并利用AFM图象分析软件对每个1 μm区域的平均粗糙度、峰值、表面积差值进行分析。并获取3种参数的具体测量值，采用SPSS13.0软件对这而种细胞的3种参数值进行方差分析,比较细胞间是否有差别。

　　2 结 果

　　2.1 细胞形态观察结果

　　星形细胞瘤细胞表面呈现层状排列的皱褶结构，胞体间见大量粗细不一的胞突，有时难以分辨它们的所属细胞。间变性星形细胞瘤细胞密度大，胞膜表达不光滑皱褶结构更为明显，瘤细胞胞突少，长短不一，但主要为较短小突起。

　　2.2 细胞膜AFM下纳米水平表现

　　利用AFM的图像分析软件系统对星形细胞瘤细胞、间变性星形细胞瘤细胞细胞膜表面重要指标即平均粗糙度(mean roughness)、峰值(peak count)和表面积差值(surface area difference)进行测量与分析(如表1)。与星形细胞瘤细胞比较，间变性星形细胞瘤细胞的平均粗糙度升高，峰值增加，表面积差值变大，具有显著性差异(P<0.05)(如图1、2)。因此可通过这三者的差异对星形细胞瘤和间变性星形细胞瘤进行鉴别诊断。

　　表1 细胞膜表面结构变化组别n平均粗糙度峰值表面积差值星形细胞瘤30033.6371030.163间变性星形细胞瘤30039.4391840.362

　　3 讨 论

　　目前，国内外文献报道中，对于星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤的鉴别诊断方面的研究，主要集中在影像学和分子生物学技术。如CT和MRI可利用灌注成像来对肿瘤的性质进行估计 [7，8]。再如，应用分子生物学技术检测星形胶质细胞瘤细胞中端粒酶、PCNA、Ki-67、ckit、MGMT等相关分子 [9-13]的表达。但是都无法从细胞的纳米级别的形态学上观察细胞的形貌差异。

　　原子力显微镜是近十几年来发展起来的超微表面分析成像技术。它可以对经典透射电镜和扫描电镜技术无法观测到的非导电材料表面纳米尺度结构进行原子水平成像和调控[14，15]。其横向分辨率达到0.1～0.2 nm，纵向分辨率达到0.01 nm，近年来逐渐被应用于生物医学领域研究。它可以在接近生理状态下在纳米尺度对组织、细胞、微生物、DNA、蛋白质[16，17]等各种生物样品进行成像和操纵。因此AFM不仅在基础医学研究领域越来越受到人们的关注!并且已逐步向临床应用过渡。利用原子力显微镜通过对细胞进行扫描，从细胞形态学方面进行肿瘤细胞良恶性的鉴别诊断，此方法更加简便快捷，诊断准确率进一步提高，对肿瘤细胞的进一步研究也有着重要意义。

　　在本实验中应用AFM对星形细胞瘤细胞、间变性星形细胞瘤细胞的细胞形态进行观测，发现无论分化程度如何，瘤细胞表面均有不同程度的皱褶，大小不等、粗细不一的胞突，且分化越好，突起越多，细而长。利用AFM图像分析软件测量细胞膜表面微细结构，星形细胞瘤细胞膜表面的平均粗糙度、峰值、表面积差值3种数据都明显低于间变性星形细胞瘤。3种数据反映了细胞膜表面蛋白的分布情况，数值越大代表膜表面的蛋白越多。这与其功能是相对应的，从星形细胞瘤细胞到间变性星形细胞瘤细胞，细胞的活跃程度是逐渐升高的，因此可以判定细胞的活跃程度的增加即可表现在细胞膜表面蛋白的变化上，蛋白的数量随之增多。该实验可清晰的观察到细胞膜表面蛋白的变化情况，证明了细胞膜表面蛋白的数量又代表着其功能状态的活跃程度。因此，本实验从形态学出发，借助AFM能够清晰呈现细胞膜表面纳米级结构的绝对优势，以星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤的细胞为研究对象，观察并分析细胞膜表面特异性的形态学变化和差异，为临床的星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤的鉴别诊断提供向导。

　　本研究表明AFM可以在纳米尺度对细胞膜表面蛋白进行直观的三维成像，并通过AFM图像分析软件系统对细胞膜表面重要指标进行测量和分析，近年来随着原子力显微镜新的操作模式的相继出现[18]，使得AFM测得的情况更接近真实情况，将会为临床诊断提供更多的帮助。(此文图1-2见第96页)

　　【参考文献】

　　[1] Binning G,Quate CF,Gerber CH.Atomic force microscope[J].Phys Rev Lett,1986, 56:930-933.

　　[2] Werten PJ,Remigy HW,Groot BL,et al.Progress in the analysis of membrane protein structure and function[J].J FEBS Lett,2002,529:65-72.

　　[3] Danker T,Mazzanti M,Tonini R,et al.Using atomic force microscopy to investigate patchclamped nuclearmembrane[J].Cell Biol Int,1997,21:747-757.

　　[4] An J, Sun JY,Yuan Q,et al.Proteomics analysis of differentially expressed metastasis associated proteins in adenoid cystic carcinoma cell lines of humansalivary gland[J] . Oral Oncol , 2004,40(4):400-408.

　　[5] 孙大业.细胞信号转导[M].第2版.北京：科学出版社，1999:28-41.

　　[6] Price RR, Viscount HB, Stanley MC,et al. Targeted profiling of oral bacteria in human saliva and in vitro biofilms with quantitative real-time PCR[J]. Biofouling,2007,23(3-4):203-213.

　　[7] Provenzale JM, Wang GR, Brenner T, et al. Comparison of permeability in high - grade and low - grade brain tumors using dynamic suscep tibility contrastMR imaging[J]. AJR,2002, 178 (3): 711 - 716.

　　[8] Signorelli F, Ruggeri F, Iofrida G,et al . Indications and limits of intraoperative cortico-subcortical mapping in brain tumor surgery: an analysis of 101 consecutive cases[J]. J Neurosurg Sci, 2007, 51(3):113-127.

　　[9] Boldrini L, Pistolesi S, Gisfredi S,et al. Telomerase activity and hTERT mRNA expression in glial tumors[J]. Int J Oncol,2006 ,28(6):1555-1560.

　　[10] Sun YH, Zhang YZ, Wang ZC, et al. Relationship between the expression of O6 methylgu anine - DNA methyltransferase in glioma and the survival time of patients[J]. Ai Zheng, 2004, 23 (9): 1052 -1055.

　　[11] Zhen HN, Zhang X, Shi CH,et al. Inhibition of growth and angiogenesis of U251 cell xenograft in vivo by short hairpin RNA targeting survivin gene[J].Ai Zheng,2006, 44(18):1270-1274.

　　[12] Kayaslcuk F, Zorludemir S, Gumurduhu D, et al. PCNA and Ki 67 in central nervous system tumors: correlation with the histological and grade[J]. Neuro Oncol, 2002, 57 (2): 115 - 121.

　　[13] Palanichamy K, Erkkinen M, Chakravarti A. Predictive and prognostic markers in human glioblastomas[J]. Curr Treat Options Oncol,2006 ,7(6):490-504.

　　[14] Chen H.Comparative observation of the recombinant adeno-associated virus 2 using transmission electron microscopy and atomic force microscopy[J].2007,13(5):384-389.

　　[15] Ueda A, Niwa O, Maruyama K, et al. Neurite imaging of living PC12 cells with scanning electrochemical/near-field optical/atomic force microscopy[J].Angew Chem Int Ed Engl,2007,46(43):8238-8241.

　　[16] Shi W, Giannotti MI, Zhang X, et al. Closed mechanoelectrochemical cycles of individual single-chain macromolecular motors by AFM[J]. Angew Chem Int Ed Engl, 2007,46(44):8400-8404.

　　[17] Atabek A, Camesano TA. Atomic force microscopy study of the effect of lipopolysaccharides and extracellular polymers on adhesion of Pseudomonas aeruginosa[J]. J Bacteriol, 2007, 189(23):8503-8509.

　　[18] Porter-Peden L, Kamper SG, Wal MV,et al. Estimating kinetic and thermodvna-mic parameters from single molecule enzyme-inhibitor I nteractions[J]. Langmuir, 2008 ,24(20):11556-11561.