联合转染Survivin和Bcl2反义寡核苷酸对裸鼠胆囊癌生长的抑制作用

　　作者：冯立民 作者单位：烟台毓璜顶医院肿瘤外科，山东 烟台 264000

　　【摘要】 目的 探讨联合转染Survivin和Bcl2反义寡核苷酸(AsODN)对裸鼠胆囊癌生长抑制作用。方法建立裸鼠胆囊癌皮下移植瘤模型，选择36只裸鼠随机分为3组：对照组、正义寡核苷酸(sODN)组和AsODN组，裸鼠瘤体内分别注射PBS、Survivin和Bcl2 sODN、Survivin和Bcl2 AsODN， 12 d后处死裸鼠，测量瘤体体积及质量，计算抑瘤率;苏木精伊红染色观察瘤体组织学变化;免疫组织化学方法检测Survivin及Bcl2蛋白的表达。结果 AsODN组裸鼠瘤体平均体积显著低于对照组、sODN组(F=24.469，q=8.802、7.569，P<0.01)，其体积抑瘤率为55.53%，sODN组为 9.90%;AsODN组裸鼠瘤体平均质量显著低于对照组、sODN组(F=25.376，q=3.168、20.737，P<0.01)，其质量抑瘤率为56.24%，sODN组为 8.47%。AsODN组瘤体中可见大量的凋亡细胞。免疫组化证实AsODN组Survivin表达明显降低，同sODN组相比差异有显著意义(F=15.103， q=5.883、7.191，P<0.01);Bcl2表达亦明显降低，同sODN组相比差异有显著性(F=6.632，q=4.793、4.030，P<0.05)。结论 联合转染Survivin和Bcl2 AsODN可下调Survivin和Bcl2表达，诱发细胞凋亡，从而抑制裸鼠胆囊癌种植瘤的生长。

　　【关键词】 胆囊肿瘤 寡核苷酸 反义 Survivin Bcl2 模型 动物

　　THE DEPRESSANT EFFECT OF COMBINING ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE TARGETING Survivin AND Bcl2 ON GALLBLADDER CARCINOMA IN NUDE MOUSEFENG LIMIN, LI GANG, SUN XIANCHUN, et al(Department of Oncosurgery, Yantai YuHuangDing Hospital, Yantai 264000, China) [ABSTRACT]ObjectiveTo evaluate the inhibitory action of combining antisense oligonucleotide targeting Survivin and Bcl2 on growth of gallbladder carcinoma in nude mouse.MethodsA model of human gallbladder carcinoma transplanted subcutaneously in nude mice was established. A total of 36 mice were divided into three groups: control group, Survivin and Bcl2 sODN group, as well as survivin and Bcl2 AsODN group. Twelve days later, the weight and volume of the tumor were measured and histology observed by HE staining, the expression of survivin and Bcl2 protein detected by immunohistochemistry SABC method.ResultsThe mean volume and weight of the tumors of AsODN group were significantly lower than that of the controls and sODN group (F=24.469,25.376;q=3.168-20.737;P<0.01). The inhibition rate of volume and weight of AsODN group was 55.53% and 56.24%, respectively, while that of sODN group was 9.90% and 8.47%. A lot of apoptotic cells were seen in tissue sections with HE staining, and the expression of survivin and Bcl2 protein was markedly lower than that of the control group and sODN group (F=15.103,6.632;q=4.030-7.191;P<0.05). ConclusionCombining antisense oligonucleotide targeting survivin and Bcl2 could inhibit the growth of subcutaneous tumors in nude mice, the reason might be that they could downregulate the expression of survivin and Bcl2 and induce apoptosis of gallbladder carcinoma cell.

　　[KEY WORDS]gallbladder neoplasms; oligonucleotides, antisense; Survivin; Bcl2; models, animal

　　反义核酸技术是近年兴起的一种生物技术，是肿瘤基因治疗的策略之一，其基本原理是根据碱基互补原则，用人工合成或生物体表达的特定互补的DNA或RNA片段(反义核酸)抑制或封闭专一靶基因表达的技术[1，2]。Survivin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族中一个结构独特的成员，特异性地表达于胚胎发育组织以及多数人类肿瘤细胞，因为其表达的特异性，故可作为肿瘤治疗的新靶点。Bcl2是最早发现的抑制细胞凋亡的蛋白，由bcl2编码，研究表明，bcl2基因的易位和高表达与肿瘤的发生密切相关。国内外的研究表明，Bcl2反义RNA可使一些肿瘤细胞Bcl2蛋白减少，细胞凋亡增加[3]。本研究建立裸鼠胆囊癌皮下移植瘤模型，观察联合应用Survivin和bcl2的反义寡核苷酸(AsODN)对裸鼠胆囊癌的抑制效果，并初步探讨其机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 寡核苷酸(ODN) 针对Survivin mRNA的AsODN序列为5′GGGGCACCCATGCCGCCGCC3′，正义寡核苷酸(sODN)序列为5′GGCGGCGGCATGGGTGCCC3′;针对Bcl2 mRNA的AsODN编码序列为5′CAGCGTGCGCCATCCTTCCC3′，sODN序列为5′GGGAAGGATGGCGCACGCTG3′。AsODN及sODN序列由上海生物工程公司采用DNA自动合成仪合成。

　　1.1.2 试剂 RPMI 1640培养液及小牛血清购自杭州四季青公司。兔抗人Survivin多克隆抗体、兔抗人Bcl2多克隆抗体、SABC及DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程公司。

　　1.1.3 细胞株 胆囊癌细胞株GBCSD系山东大学齐鲁医院普外科构建。

　　1.1.4 实验动物 BALB/cnu/nu裸小鼠，4～6周龄，雌雄兼用，体质量18～23 g，购自中国医学科学院实验动物研究所。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 裸小鼠胆囊癌模型的建立 取处于对数生长期1×1010/L的GBCSD胆囊癌细胞，于每只裸鼠一侧背部皮下接种0.2 mL单细胞悬液，以皮下结节直径超过0.5 cm为成瘤标准。所有裸鼠于接种细胞后2周左右成瘤，成瘤率100%。

　　1.2.2 抑制种植瘤实验 取成瘤后裸鼠36只，称体质量后随机分为3组，每组12只。对照组每只裸鼠瘤体内多点注射PBS 0.3 mL， sODN组每只裸鼠瘤体内多点注射50 μL脂质体( Lipofectin)+Survivin sODN及Bcl2 sODN各100 μg(0.3 mL)，AsODN组每只裸鼠瘤体内均行多点注射50 μL的Lipofectin+Survivin AsODN及Bcl2 AsODN各100 μg(0.3 mL)，每天注射1次。于注射后12 d断颈处死裸鼠，剥离肿瘤，分别测量肿瘤长轴(L)、短轴(W)，根据公式V=1/2 LW2计算肿瘤体积，称量瘤质量。然后将肿瘤组织储存于液氮中备用。肿瘤生长抑制率计算公式为：体积抑制率=(1-治疗组平均体积/对照组平均体积)×100%，质量抑制率=(1-治疗组平均质量/对照组平均质量)×100%。

　　1.2.3 Survivin及Bcl2蛋白表达的检测 采用免疫组织化学(SABC)法。

　　1.2.4 染色结果判定标准 细胞浆染成黄色或棕黄色为阳性染色。采用Leica全自动图像分析系统(德国)，以阳性单位(PU)表示染色强度。随机选取5个高倍视野，选取灰度参数，计算 PU。PU=|Gα-Gβ|/Gmax×100%。其中Gα为切片中所测内容的平均灰度，Gβ为切片中的背景灰度，Gmax为最大灰度值。

　　1.2.5 细胞组织学观察 组织切片采用苏木精伊红染色方法染色。

　　1.3 统计学方法

　　采用SPSS 11.5 for Windows统计软件进行数据处理，数据间比较采用单向方差分析(LSD法)。

　　2 结 果

　　2.1 联合转染Survivin AsODN和Bcl2 AsODN对裸鼠胆囊癌生长的抑制作用

　　裸鼠成瘤后，经过12 d的治疗，AsODN组裸鼠肿瘤体积明显小于对照组和sODN组，差异有显著性(F=24.469，q=8.802、7.569，P<0.01)，而对照组和sODN组之间的差异无显著意义(P>0.05)。AsODN组裸鼠肿瘤质量明显小于对照组和sODN组，差异有显著意义(F=25.376，q=3.168、20.737，P<0.01)，而对照组和sODN组之间差异无显著意义(P>0.05)。见表1。

　　2.2 Survivin及Bcl2蛋白表达

　　对照组、sODN组、AsODN组胆囊癌组织中均有Survivin及Bcl2蛋白的表达，主要位于细胞浆。AsODN组Survivin 的 染色强度明显低于对照组和sODN组，差异有显著性(F=15.103，q=5.883、7.191，P<0.01)，而对照组和sODN组之间差异无显著性(P>0.05)。AsODN组Bcl2的 染色强度明显低于对照组和sODN组，差异有显著性(F=6.632，q=4.793、4.030，P<0.05)，而对照组和sODN组之间差异无显著性(P>0.05)。见表2。表1 联合转染Survivin及Bcl2 AsODN对裸鼠皮下瘤生长的影响表2 联合转染Survivin及Bcl2 AsODN后Survivin及Bcl2的表达(n=12,±s)组 别SuvivinBcl2对照组1.78±0.351.56±0.37sODN组1.66±0.321.49±0.33AsODN组1.07±0.281.12±0.24

　　2.3 组织学观察

　　对照组及sODN组肿瘤细胞异型性明显，可见瘤巨细胞及多核瘤细胞，部分区域呈实性巢状排列，许多瘤细胞排列松散。AsODN组肿瘤组织出现坏死区，可见淋巴细胞，并出现单个散在分布的，细胞核蓝染、碎裂、致密，胞浆淡红色的凋亡细胞。

　　3 讨 论

　　胆囊癌是恶性程度较高的恶性肿瘤，术后5年生存率低于5%。目前常规的治疗方法仍以手术切除为主，辅助放射治疗和化疗，但效果不理想。基因治疗是近年来研究的热点，有望成为继手术、化疗和放疗后的另一种有前途的肿瘤治疗方法。目前，AsODN已经成为治疗肿瘤等由于基因异常而引起的疾病的一类潜在性药物，为癌症的特异性治疗带来了希望。

　　细胞凋亡在肿瘤的发生、发展中起着重要的作用，而IAP、Bcl2家族与凋亡密切相关。凋亡的调控主要通过IAP和Bcl2家族成员直接或间接抑制Caspase家族成员的活化来完成[4]。Suvivin基因是IAP家族的一个新成员,与效应细胞蛋白酶受体1位于人染色体17q25的同一基因组，与G1期调节蛋白相互作用，控制着各种G2M期调节细胞周期依赖基因表达[5，6]。有研究显示，Survivin蛋白在肝癌组织中的表达率为48.8%，而在癌旁组织、肝硬化组织和正常肝组织中均未见表达[7]。作为凋亡抑制蛋白，因为其仅在肿瘤组织中表达而在正常组织不表达或低表达[8]，使其靶向具有较好的特异性。GROSSMAN等[9]转染针对Survivin的AsODN到角质形成细胞株HaCat细胞，导致内源性Survivin水平下降，细胞凋亡。MESRI等[10]报道，针对Survivin的AsODN可抑制血管内皮生长因子介导的内皮细胞保护作用，促进肿瘤血管形成过程中内皮细胞的凋亡和血管的退行改变。

　　bcl2基因是Bcl2家族的重要一员，其编码的蛋白位于线粒体的外膜、核外膜和内质网外膜，主要通过抑制细胞色素C的释放来抑制细胞凋亡，增加肿瘤细胞数。因此，目前认为其异常表达与肿瘤的发生和发展有关。陆平等[11]报道，AsODN作用于胃癌细胞后降低了Bcl2蛋白及其mRNA的表达,并可见胃癌细胞出现凋亡特征性改变。

　　杀死和清除肿瘤细胞是治疗肿瘤的基本手段，由于细胞凋亡失衡是肿瘤形成及发展的重要原因，诱导肿瘤细胞凋亡无疑是治疗肿瘤的一条有效途径。与抑制或杀死肿瘤细胞的同时对健康组织带来损伤的治疗方法相比，肿瘤细胞凋亡疗法可能会有效而无副作用。肿瘤的发生发展是多基因、多因素共同作用的结果，在不同的发展阶段，不同的癌基因或抑癌基因的数目、种类、作用方式各不相同，仅针对单一基因治疗的AsODN不能起到完全抑制肿瘤细胞生长的目的。因此，我们分别设计了针对Survivin和bcl2基因的AsODN(全硫代修饰)，经人工合成后以阳离子脂质体为载体直接注射入裸鼠的胆囊癌瘤体组织中，结果显示，联合转染Survivin和bcl2基因的AsODN能够明显地抑制肿瘤的生长，AsODN组裸鼠肿瘤体积和质量明显小于对照组和sODN组;sODN组和对照组之间肿瘤体积、质量无明显差异;AsODN组肿瘤质量和体积抑制率分别为56.24%和55.53%，而sODN组仅为8.47%和9.90%，两组比较差异有显著性，表明联合转染针对Survivin和bcl2的AsODN对裸鼠皮下移植瘤的生长具有抑制作用。免疫组化观察结果显示，经联合转染后，Survivin和Bcl2蛋白表达显著下降。组织学观察结果显示，AsODN组肿瘤组织出现坏死区，可见淋巴细胞及单个散在分布的细胞核蓝染、碎裂、致密、胞浆淡红色的凋亡细胞。说明联合应用Survivin和Bcl2 AsODN可抑制Survivin和Bcl2 mRNA的表达，从而促进细胞凋亡。

　　因为不存在外源性基因整合到宿主细胞DNA分子的过程，所以，应用AsODN抑制异常基因的表达，从而抑制肿瘤的生长，是一种比较安全的方法。AsODN基因治疗与其他形式的基因治疗如利用逆转录病毒或质粒为载体的基因转染技术比较，安全性高，且简单易行，易于在临床推广。

　　【参考文献】

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　　[8]SARELA A I, MACADAM R C, FARMERY S M, et al. Expression of the antiapoptosis gene, survivin, predicts death from recurrent colorectal carcinoma[J]. Gut, 2000,46(5):645650.

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　　[10]MESRI M, MORALESRUIZ M, ACKERMANN E J, et al. Suppression of vascular endothelial growth factormediated endothelialcell protection by survivin targeting[J]. Am J Pathol, 2001,158(5):17571765.

　　[11]陆平,陈峻青. Bcl2反义寡核苷酸诱导胃癌细胞凋亡的研究[J]. 中华肿瘤杂志, 1999,21(4):253255.