参芪注射液对H22荷瘤小鼠抑瘤作用的细胞免疫机制

　　作者：梅龙，董晓慧，段刚，苟伟 作者单位：(西安交通大学医学院免疫学及病原生物学系;西安交通大学医学院药理学系，陕西西安 710061;陕西省地方病防治研究所，陕西西安 710003)

　　【摘要】 目的 研究参芪注射液的体内抑瘤效应与荷瘤机体细胞免疫功能的关系, 探讨其抑瘤作用的细胞免疫学机制。方法 建立小鼠H22肝癌实体瘤模型，分别给予高、中、低剂量参芪注射液，测定各组小鼠肿瘤生长抑制率(IR)和腹腔巨噬细胞的吞噬指数;采用MTT法测定各组小鼠脾淋巴细胞增殖指数;ELISA法检测各组小鼠血清中白细胞介素2(IL2)和γ干扰素(IFNγ)水平。结果 高、中剂量参芪注射液实验组小鼠H22实体瘤IR分别为60.72%和48.65%，与模型组比较有显著性差异(P<0.05);参芪注射液实验组小鼠脾脏淋巴细胞增值指数、腹腔巨嗜细胞吞噬指数、血清IL2和IFNγ的含量都显著高于模型组小鼠(P<0.05)。结论 参芪注射液通过提高荷瘤小鼠的细胞免疫功能，改善荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫状态，协同对肿瘤细胞的直接杀伤作用，在荷瘤小鼠体内发挥其抑瘤抗瘤作用。

　　【关键词】 荷瘤小鼠;参芪注射液;抑瘤率;白细胞介素2;γ干扰素;细胞免疫功能

　　Cellular immune mechanism of antitumor efficacy of　Shenqi injection in H22 tumorbearing mice

　　Mei Long, Dong Xiaohui, Duan Gang, Gou Wei

　　(Department of Immunology and Pathogenic Biology; Department of Pharmacology, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061;Shaanxi Provincial Institute of Endemic Disease Control, Xian 710003, China)

　　ABSTRACT: Objective To investigate the relationship between in vivo antitumor efficacy of Shenqi injection and its effect on immunologic function in H22 tumorbearing model mice, and explore the cellular immunologic mechanism of Shenqi injection in inhibiting tumor growth. Methods Three different doses of Shenqi injection were given to H22 tumorbearing model mice in treatment groups. The tumor growth inhibitory rate (IR) and the index of phagocytosis of peritoneal macrophage were calculated. MTT assay was used to observe the effect of Shenqi injection on spleen lymphocytes stimulated by ConA in vitro separated from H22 tumorbearing mice. Murine serum IL2 and IFNγ were detected by means of ELISA assay. Results IR was significantly reduced in two treatment groups compared with that of the model mice (60.72%, 48.65%, P<0.05). The spleen lymphocyte stimulation index, the index of phagocytosis, and the level of serum IL2 and IFNγ were significantly increased in treatment groups compared with those of the model groups (P<0.05). Conclusion Shenqi injection may directly kill the tumor cells by increasing the cellular immunologic function or improving the antitumor immunologic function in tumorbearing mice.

　　KEY WORDS: tumor bearing mouse; Shenqi injection(SQI); inhibitory rate (IR); interleukin2 (IL2); interferonγ (IFNγ); cellular immune function

　　参芪注射液(Shenqi injection, SQI)是由人参、黄芪、当归等诸药提取物组成的中药混合制剂，具有扶正祛邪、抗肿瘤和免疫调节作用，已应用于临床。实验研究证实，参芪注射液中的主要成分如人参多糖、黄芪多糖等在体外可以杀伤肿瘤细胞，但却有明显的时间和剂量依赖性，在体外的有效抑瘤浓度与动物实验所取得的结果有较大出入，其抑瘤作用机制尚不明确。机体的细胞免疫是构成抗肿瘤免疫的基础，影响细胞免疫的因素必定也与肿瘤的发生、发展有密切关系。在本研究中，我们采用H22肝癌实体瘤模型，分析参芪注射液的抑瘤效果与荷瘤小鼠细胞免疫之间的关系，探讨参芪注射液抗肿瘤作用的细胞免疫机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物及瘤株 ICR封闭群小鼠200只，体重(20±2)g，雌雄各半，由西安交通大学医学院医学实验动物中心提供;小鼠H22肝癌实体瘤细胞株，由西安交通大学医学院药理学系提供。

　　1.2 药品、试剂及仪器 参芪注射液，2.0g生药/mL，丽珠集团利民制药厂提供，批号051019;小鼠白细胞介素2、小鼠γ干扰素ELISA检测试剂盒，购自上海森雄科技实业有限公司;噻唑蓝(MTT)，瑞士Fluka公司;刀豆蛋白(ConA)，美国Sigma公司;DJ5031酶联免疫检测仪，华东电子集团医疗装备有限责任公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 动物分组、造模、给药 将ICR小鼠随机平均分为5组：H22肝癌实体瘤模型组，高、中、低剂量SQI实验组和正常对照组，每组10只小鼠，雌雄各半。模型组和3个SQI实验组小鼠腋下接种H22肝癌实体瘤细胞悬液(2×107/mL)0.2mL。24h后，高、中、低剂量SQI实验组小鼠分别腹腔注射给予参芪注射液12、6、3g生药/kg。模型组和正常对照组小鼠腹腔给予氯化钠注射液0.2mL。连续给药10d。

　　1.3.2 抑瘤率的测定 给药10d后处死小鼠，剥瘤称量，计算各组肿瘤生长抑制率(抑瘤率，IR)。IR=(模型组平均瘤重量实验组平均瘤重量)/模型组平均瘤重量×100%

　　1.3.3 腹腔巨噬细胞功能的测定 小鼠分组、造模及给药方法同上。给药10d后，测定各组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数[1]。

　　1.3.4 脾脏淋巴细胞增殖指数 小鼠分组、造模及给药方法同上。给药10d后断颈处死小鼠，摘取脾脏，MTT法测定各组小鼠脾淋巴细胞转化指数[2]。

　　1.3.5 血清IL2和IFNγ的含量测定 小鼠分组、造模及给药方法同上。给药10d后，采血分离血清，严格按试剂盒说明书测定各组小鼠血清IL2和IFNγ的含量。

　　1.3.6 统计学处理 使用SPSS10.0版统计软件进行数据处理，计量资料用±s表示，组间比较采用方差分析(OneWay ANOVA)，方差齐时选用LSD(LeastSignificant Difference)法，方差不齐时选用Dunnetts法，显著性水准设为P<0.05。

　　2 结果

　　2.1 各组小鼠H22瘤重及抑瘤率 SQI高、中剂量实验组小鼠H22肝癌实体瘤瘤重与模型组比较明显减轻，差异显著(P<0.05，表1)。

　　表1 各组小鼠H22瘤重及抑瘤率(略)

　　Table 1 H22 tumor weight and IR of the mice in each group

　　*P<0.05 vs. model group; IR: inhibitory rate

　　2.2 各组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率、吞噬指数及脾淋巴细胞增殖指数 模型组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率、吞噬指数和腺淋巴细胞增殖指数均显著低于正常对照组小鼠(P<0.05)。高、中剂量SQI实验组荷瘤鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数显著高于模型组小鼠(P<0.05)。三个剂量SQI实验组小鼠脾淋巴细胞增殖指数均显著高于模型组(P<0.05，表2)。

　　2.3 各组小鼠血清IL2、IFNγ的含量 模型组小鼠血清IL2、IFNγ含量显著低于正常对照组小鼠(P<0.05)，高、中剂量SQI实验组小鼠血清IL2、IFNγ明显高于模型组小鼠(P<0.05，表3)。

　　表2 各组小鼠巨噬细胞吞噬百分率、吞噬指数及脾淋巴细胞增殖指数(略)

　　Table 2 Percentage of macrophage, index of phagocytosis and spleen lymphocyte multiplication index of the mice in each group

　　*P<0.05 vs. model group

　　3 讨论

　　针对肿瘤以及病毒感染等，细胞免疫是机体的重要防御因素。机体细胞免疫功能状态，尤其是机体的抗肿瘤免疫水平在肿瘤的发生及发展过程中发挥着及其重要的作用[3]。单核巨噬细胞系统是机体保持内环境稳定的一个最重要系统，广泛参与免疫应答、免疫效应和免疫调节。巨噬细胞的吞噬功能是衡量机体细胞免疫水平的一个重要标志，是机体细胞免疫清除突变细胞、抑瘤抗瘤的重要因素。T淋巴细胞是介导机体细胞免疫的免疫活性细胞，在免疫应答全过程中起着重要的调节、效应作用。但淋巴细胞只有转化为淋巴母细胞才能发挥免疫调节作用，T淋巴细胞转化率(增殖指数)的高低直接反映机体细胞免疫的水平。IL2主要是由Th1细胞产生的一种具有免疫调节作用的多肽类激素。IL2能促进相应靶细胞增殖，支持T细胞的持续产生，活化NK细胞。IL2主要通过诱导生成淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)，诱导IL2、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)的产生，并通过直接的细胞接触增强细胞毒活性等在抗肿瘤免疫中发挥作用[45]。IFNγ是机体受病毒或其他IFN诱生剂刺激，由辅助性T细胞产生的活性糖蛋白，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生物学功能。IFNγ通过抑制肿瘤细胞的增生，改变肿瘤细胞表面的性能及诱发新的抗原而被免疫监视细胞识别并加以排斥，实现抗肿瘤效应和增强机体抗肿瘤能力。另外，IFNγ还可以促进其他细胞因子的抗肿瘤作用[6]。小鼠H22肝癌实体瘤是抗肿瘤药物研究中常用的动物移植性肿瘤模型。本实验利用此模型观察了参芪注射液的体内抑瘤作用，结果表明参芪注射液对小鼠H22肝癌实体瘤的生长有明显的抑制作用，抑瘤率达60%以上。在本实验中我们发现，小鼠在接种了H22后，腹腔巨噬细胞的吞噬功能、脾淋巴细胞的增殖指数、血清IL2和IFNγ含量均显著低于正常对照小鼠，说明小鼠接种肿瘤细胞后，机体的细胞免疫功能被抑制。这是因为肿瘤细胞分泌的可溶性免疫抑制因子诱导免疫抑制细胞活化，进一步削弱了机体整体的免疫功能。该结果与临床上肿瘤患者多表现不同程度的免疫功能减弱是一致的。机体免疫功能抑制或紊乱，使肿瘤细胞能够逃避机体免疫系统对其的杀伤作用，有利于肿瘤的发生和发展。现代药理学研究表明，人参和黄芪均能不同程度地提高和调节机体的免疫功能，其活性成分为皂甙和多糖。多糖作为生物效应调节剂可影响网状内皮系统、外周血T淋巴细胞、NK细胞及巨噬细胞，并影响补体的形成以及细胞因子的分泌。人参的活性成份Rg1在体内或体外均能促进淋巴细胞增殖，促进IL2基因和IL2R表达，从而促进IL2的合成和释放。研究表明中药及其有效成分能够通过诱导机体产生IFNγ来增强其抗肿瘤和免疫调节功能。黄芪多糖、刺五加多糖、茯苓多糖、人参等能均诱导IFNγ的产生。此外，中药皂甙和多糖还具有抗肿瘤、诱导肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤血管形成等生物活性，能够直接杀伤肿瘤细胞。以往的研究也发现，诸多中药活性成分对肿瘤细胞的直接杀伤作用具有明显的时间和剂量依赖性，有效抑瘤浓度在体内应用就有很强的细胞毒性作用。而动物实验的结果表明，中药的活性成分在体内远小于其有效抑瘤浓度时即可发挥明显的抑瘤作用。这些研究结果提示，中药活性成分之所以在体内有良好的抑瘤作用，不是仅依靠对肿瘤细胞的直接杀伤作用，还与其能提高机体细胞免疫水平，改善抗肿瘤免疫状态有密切关系[79]。在本实验中，参芪注射液对荷瘤小鼠巨噬细胞、T淋巴细胞数量的提升和活化，对血清IL2和IFNγ含量的提升作用显著，表明参芪注射液能够改善和提高荷瘤鼠细胞免疫功能，发挥免疫调节和抑瘤效应。在诸多中药活性成分的共同作用下，通过对巨噬细胞、T淋巴细胞功能的改善，进一步促进了IL2分泌，继而通过IL2的生物学效能，广泛参与机体免疫反应的调控。参芪注射液中所含的中药活性成分可能首先诱导Th1细胞分泌高水平的IL2，进而活化NK细胞、巨噬细胞，促进这些对肿瘤细胞的杀伤作用。也可能是直接刺激巨噬细胞活化，通过活化的巨噬细胞分泌高水平的非特异性免疫效应分子，再进一步活化非特异性杀伤细胞对肿瘤细胞的作用。其作用环节有待进一步研究。肿瘤患者的免疫功能受到抑制，尤其是晚期肿瘤患者在经过长期化疗/放疗后，免疫功能低下尤为明显。由于机体免疫功能状态与肿瘤的发病及预后密切相关，因此，改善机体免疫状态，尤其是提高细胞免疫功能已成为肿瘤防治中不可忽视的环节。中药具有药源充足、疗效显著、毒副作用小及不易产生耐药性等优点，具有广阔的应用前景。

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