富勒醇对小鼠移植性肝癌抑瘤作用的初步研究

　　作者：沈方臻，王秀美 ，陈滇宝 (青岛大学医学院附属医院肿瘤科，山东 青岛 266003; 青岛大学医学院附属医院特需病房; 青岛科技大学高分子科学与工程学院)

　　[摘要]目的 研究富勒醇对小鼠移植性肝癌生长的抑制作用。方法 将荷瘤小鼠分为4组:4.8 g/L和 2.4 g/ L的富勒醇组，氟尿嘧啶组及空白对照组。分别腹腔注射相应的药物及注射用水后，给予光照射，连续7 d。之后处死小鼠，记录瘤质量。结果 4.8 g/L和2.4 g/L的富勒醇组平均瘤质量均低于空白对照组( F= 58.89，q=4.28、4.40，P <0.01)，两种浓度富勒醇组之间瘤质量差异无显著性( q=1.32，P >0.05)。氟尿嘧啶组平均瘤质量明显低于4.8 g/L和2.4 g/L富勒醇组( q=3.97、4.51，P <0.01)，但其毒性作用大于富勒醇组。结论富勒醇对小鼠移植性肝癌的生长均有明显抑制作用，且毒性作用较氟尿嘧啶小。

　　[关键词] 富勒醇;肝肿瘤;抑瘤作用;小鼠

　　INHIBITIVE EFFECT OF FULLERENOLS ON GROWTH OF TRANSPLANTED HEPATOCARCINOMA IN MICE

　　SHEN FANG-ZHEN， WANG XIU-MEI， CHEN DIAN-BAO

　　(Department of Oncology， The Affiliated Hospital of Qingdao University Me- dical College， Qingdao 266003， China)

　　[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the inhibitive effect of fullerenols on the growth of transplanted hepatocarcinoma in mice. MethodsForty-eight tumor-bearing mice were divided into four groups: fullenrenols (high and low concentration) groups， FU group， and blank group. The corresponding drugs and distilled water for injection were injected intra-abdominally for each group， and photoradiation was given for seven days. Then the animals were killed and tumor weight measured. Results Tumor weight was lower in fullerenols groups compared with blank group ( F=58.89;q=4.28，4.40;P <0.01)， with no signifi-cant difference between high and low concentration fullerenols groups ( q=1.32，P >0.05).Tumor weight was lower in FU group compared with fullerenols and blank groups， respectively ( q=3.97，4.89;P <0.01). The toxic effects were more serious in FU group. ConclusionFullerenols can inhibit the growth of transplanted hepatocarcinoma in mice and has few adverse reactions.

　　[KEY WORDS]fullerenols; liver neoplasms; antitumor effect; mice

　　纳米分子富勒烯(C60)问世已有20年历史，随着对C60及其衍生物富勒醇的研究不断深入，人们对其理解不仅停留在物理化学和材料科学领域，也已深入到生物化学、生物医学领域。特别是近年来C60及其衍生物的研究已进入到肿瘤学研究中，并显示出令人瞩目的趋势[1]。我们利用自行研制的富勒醇C60(OH)n/C70(OH)n，在移植性肝癌小鼠体内进行抗瘤实验，对其抗肿瘤活性进行初步研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品与试剂 富勒醇C60(OH)n/C70(OH)n由青岛科技大学陈滇宝教授研制，实验时用无菌注射用水配制所需浓度。并用0.22 μm滤膜除菌过滤备用。氟尿嘧啶每支250 mg，实验时以无菌注射用水配制成浓度2 g/L溶液备用。

　　1.2 瘤株与动物 腹水型肝癌荷瘤小鼠由山东省医学科学院药物研究所提供。昆明种小鼠由青岛药品检验所实验动物室提供，雌雄各半，体质量18～22 g。

　　1.3移植性小鼠肝癌模型的制备[2] 腹水型肝癌瘤株在昆明种小鼠腹腔内接种传代后1周时，无菌抽取癌性腹水，光镜下计数，用无菌生理盐水稀释细胞至1010/L，于每只健康昆明种小鼠腋窝皮下接种0.2 mL(瘤细胞2×106 个)。

　　1.4 动物分组及药物注射 接种后的小鼠随机分为4组:4.8及2.4 g/L富勒醇组、氟尿嘧啶阳性对照组、注射用水空白对照组，每组12只。在肿瘤接种后24 h，每只小鼠腹腔注射相应药物0.2 mL/d，连用7 d。每天用药后，置各组小鼠于60 W日光灯下照射4 h。

　　1.5 结果观察 实验过程中观察各组小鼠的一般状况及肿瘤生 长情况，记录动物死亡时间。于停止用药后 24 h ，处死小鼠，称瘤质量，计算抑瘤率。抑瘤率=(对照组平均瘤质量-用药组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量×100%。

　　1.6 统计学处理 结果以 x±s 表示，统计学处理用方差分析。

　　2 结果

　　2.1 动物一般状况 应用富勒醇两组小鼠饮食正常，活动生长良好，皮毛有光泽，无体质量下降，实验过程中无死亡。氟尿嘧啶组小鼠饮食欠佳，进食减少，体质量降低，皮毛稀疏、干燥、无光泽，实验过程中死亡2只(用药第5、6天各1只)。空白对照组饮食生长尚可，体质量下降不明显，皮毛干燥、光泽差。

　　2.2 各组小鼠平均瘤质量和抑瘤率 与空白对照组相比，4.8及2.4 g/L富勒醇对小鼠移植性肝癌的生长均有抑制作用，平均瘤质量明显降低( F=58.89，q=4.28、4.40，P <0.01)。 4.8 g/ L富勒醇组平均瘤质量低于2.4 g/L组，但二者之间差异无显著性( q=1.32，P >0.05)。氟尿嘧啶组平均瘤质量明显低于空白对照组( q=4.89，P <0.01)，也明显低于4.8及2.4 g/L富勒醇组( q= 3.97、4.51，P <0.01)。见表1。

　　表1 富勒醇对小鼠移植性肝癌生长的影响(略)

　　3 讨论

　　C60是碳的第三种同位素异构体，1985年首先由美国科学家CURL和SMALLEY以及英国科学家KROTO发现。C60不溶于水，通过与两亲性物质形成超分子复合物及结合亲水性的极性功能团，可以制备一系列C60水溶性复合物，由陈滇宝教授研制的C60羟基衍生物富勒醇C60(OH)n/C70(OH)n即为其中之一。研究发现，C60及其衍生物具有多种生物学活性[1]:可以抑制某些酶的活性，如半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶，并能降低体外培养A7r5细胞膜酪氨酸激酶活性，对人免疫缺陷病毒(HIV)也具有抑制作用。富勒醇通过增加体内抗氧化酶的活性，促 进自由基的清除，以及促进造血和免疫细胞增殖，对60钴 γ射线的辐射损伤修复起到促进作用[3]。C60及其衍生物又具有光动力学作用，在紫外线及可见光区均有广泛的吸收，在光的激发下，产生单线态氧，在捕获一个电子后，又进一步生成氧自由基负离子，二者均有强氧化性，可致细胞膜的损伤。体外实验发现，C60衍生物经光照射后可引发HeLa细胞膜的损伤，加速细胞不可逆死亡[4]。接种纤维肉瘤的小鼠用化学修饰的C60处理并经光照射，对肿瘤的生长产生抑制作用。另外，用富勒醇进行人喉癌细胞株Hep-2及人宫颈癌细胞株HeLa的生长抑制实验，成功观察到光动力杀伤和诱导细胞凋亡的双重作用，而且低浓度富勒醇在避光条件下也可诱发肿瘤细胞的凋亡。我们在研究中观察到，接种肝癌的小鼠在被注射富勒醇并经光照射处理后，肿瘤的生长受到抑制，表现为平均瘤质量明显低于空白对照组。4.8及 2.4 g/L富 勒醇组之间，平均瘤质量差异无显著性，提示较低浓度的富勒醇对小鼠移植性肝癌的生长也能起到抑制作用。富勒醇抑瘤作用的机制可能与其光动力学效应导致的肿瘤细胞膜损伤，以及诱导细胞凋亡有关，也可能与富勒醇对宿主免疫功能的促进，提高机体抗肿瘤免疫相关。与氟尿嘧啶阳性对照组相比较，富勒醇组的抑瘤作用低于前者，提示二者作用机制可能有所不同。由实验结果也可看出，治疗剂量的氟尿嘧啶毒性明显高于富勒醇组，表现为氟尿嘧啶组小鼠进食差，体质量下降，皮毛脱落、无光泽，而且有2只小鼠在实验过程中死亡。提示富勒醇在产生有效抑瘤作用的同时，毒性作用低于一般化疗药物。本实验只是对富勒醇C60(OH)n/C70(OH)n体内抑瘤作用的初步研究，其抗瘤作用的明确机制尚需进行一系列的探讨。

　　[参考文献]

　　[1] 杨卫海，陈滇宝，王秀美. 富勒烯和富勒醇的生物学和生物医学应用研究[J].药学进展，2004，28(6):243-246.

　　[2] 韩锐.肿瘤化学预防及药物治疗[M]. 北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社， 1991:16-26.

　　[3] 蔡小青，李宇国，吴胜伟，等. 富勒醇对60CO γ射线致小鼠损伤的防护作用[J].中华放射医学与防护杂志，2004，24(6):520-522.

　　[4] 李强国，曾煌，冯英，等. 微量热法研究富勒烯衍生物对HL-60细胞代谢[J].武汉大学学报:自然科学版，1999，45(4):419-422.