原癌基因Fra-1高表达与乳腺癌细胞转移表型的关系

　　作者：宋玉华，宋三泰，江泽飞，钱露，陈立勇，郭宁 作者单位：青岛大学医学院附属医院肿瘤科，山东青岛 266031;军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850;军事医学科学院附属医院，北京 100071

　　【摘要】 目的 研究原癌基因Fra-1与人乳腺癌细胞系MCF-7细胞侵袭及迁移的关系。方法 提取乳腺癌细胞系MDA231细胞的总RNA，通过RT-PCR扩增Fra-1全长基因，将其克隆入pcDNA3.1(-)myc-his表达载体;应用脂质体法转染MCF-7细胞，观察Fra-1过表达对MCF-7细胞增殖、黏附和迁移的影响。结果 高表达Fra-1增强了MCF-7细胞的增殖、黏附和迁移的能力。结论 原癌基因Fra-1可能通过促进肿瘤细胞的增殖、黏附和迁移，在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中发挥作用。

　　【关键词】 乳腺癌;Fra-1;AP-1;肿瘤转移;重组质粒;转染

　　Association of overexpression of proto-oncogene Fra-1 with the metastatic phenotype of breast cancer cells

　　Song Yuhua, Song Santai, Jiang Zefei,Qian Lu, Chen Liyong, Guo Ning

　　1. The Department of Oncology, Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003;

　　2. Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Sciences, Beijing 100850;

　　3. Affiliated Hospital, Academy of Military Medical Science, Beijing 100071, China

　　ABSTRACT: Objective To illustrate the association of Fra-1 overexpression with motility and invasiveness of breast cancer cells. Methods Fra-1 gene was obtained by RT-PCR. PCR products were cloned into the plasmid pcDNA3.1(-) myc-his to create the recombinant plasmid pcDNA3.1(-) myc-his/Fra-1. The plasmid was then transfected into human breast cancer cell line MCF-7. The proliferation, adhesion and migration of MCF-7 cells stably overexpressing Fra-1 were investigated. Results The enhanced growth, adhesion and migration of MCF-7 cells overexpressing Fra-1 were observed. Conclusion Invasiveness and metastasis of tumor cells could be promoted by Fra-1 mediated enhancement of adhesion and migration of tumor cells.

　　KEY WORDS: breast cancer; Fra-1; AP-1; metastasis; recombinant plasmid; transfection

　　激活蛋白-1(activator protein-1, AP-1)是人类细胞中一种重要的核转录因子。AP-1信号通路的活化与细胞的癌变、增殖分化、凋亡等多种生物学效应有关，尤其在肿瘤细胞的运动迁移、细胞外基质的降解、肿瘤细胞的异常黏附以及转移灶新生血管生长等多个侵袭转移的环节中发挥重要的作用[1]。哺乳动物细胞中AP-1主要由Jun、Fos亚家族组成[2]。

　　Fra-1为Fos家族中的一员，由于Fra-1没有转录激活区，早期的研究推测Fra-1可能参与AP-1的负向调控[3]。但是，近年来的研究显示，Fra-1具有转录激活能力及转化活性。有学者报道，Fra-1在鼠的成纤维细胞中过表达可导致裸鼠体内肿瘤形成[4];诱导Fra-1表达可导致逆转录病毒转化的小鼠甲状腺细胞在体内成瘤[5];在多种上皮性肿瘤，如甲状腺癌、头颈鳞状上皮癌等肿瘤中均可检测到Fra-1的高表达[6-7]。最近的研究发现，Fra-1与乳腺癌细胞系增强的侵袭能力相关，在过表达Fra-1的MCF-7 细胞中，基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、血管内皮生长因子(VEGF)以及细胞周期素D1(cyclin D1)的表达上调，提示Fra-1可能影响肿瘤细胞的增殖、侵袭及血管形成[8]。本研究构建了人原癌基因Fra-1的真核表达载体, 在人乳腺癌细胞系MCF-7细胞中获得稳定表达，观察了Fra-1过表达对乳腺癌细胞增殖、黏附和迁移的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　乳腺癌细胞系MCF-7、MDA231及大肠杆菌JM109均为本室常规保存;DMEM培养基购自Gibco公司;LipofectamineTM、TRIZOL和pcDNA3.1(-)/Myc-His为Invitrogen公司产品;限制性内切酶均购自New England Biolabs公司;Matrigel购自BD Biosciences生物公司;逆转录酶和T4 DNA连接酶购自Promega公司;Pyrobest DNA聚合酶、DNA分子量标准DL2000和DNA片段回收试剂盒为TaKaRa公司产品;质粒提取试剂盒购自博大泰克公司;引物合成及测序由英俊生物有限公司完成;抗Fra-1、抗myc鼠单克隆抗体为Santa Cruz公司产品;抗GAPDH鼠单克隆抗体购自上海康成公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自北京中山生物有限公司;增敏化学发光底物试剂(ECL)为Pierce公司产品。

　　1.2 方法

　　按照Trizol一步法提取MDA231细胞总RNA。测定RNA浓度和纯度，电泳检测RNA质量。 以总RNA为模板，Oligo(dT)15为引物，按照AMV反转录酶说明书进行反转录，总反应体积为25 μL。

　　1.2.1 目的基因Fra-1的PCR扩增

　　根据GenBank登录的Fra-1基因序列，在相对于翻译起始密码ATG和终止密码TGA前设计上下游引物，扩增Fra-1全长基因。上、下游引物分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点，上游引物：5′-GGAATTCCACCATGTTCCGAGACTTCGGGGA-3′，下游引物：5′-CGGGATCCCAAAGCGAGGAGGGTT-3′，下划线处为酶切位点。以MDA231细胞的cDNA为模板，扩增Fra-1基因。PCR反应参数：94 ℃变性5 min;然后94 ℃变性45 s、55 ℃退火55 s、72 ℃延伸1 min，进行30个循环;最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分离。

　　1.2.2 重组质粒载体的构建

　　按DNA片段回收试剂盒说明回收扩增的Fra-1片断。用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切pcDNA3.1(-)/Myc-His质粒和PCR纯化产物，10 g/L琼脂糖凝胶电泳分离酶切的质粒和PCR产物，并回收纯化目的片段。用T4 DNA连接酶连接pcDNA3.1(-)/Myc-His质粒和Fra-1的PCR产物的酶切片段，用连接反应产物转化大肠杆菌JM109。转化后的感受态细胞涂于含氨苄青霉素(Amp)100 μg/mL琼脂平板上，于37 ℃下培养16 h。

　　1.2.3 重组质粒的筛选、鉴定与测序

　　从琼脂糖平板上挑取白色单一菌落，接种含Amp的LB液体培养基中，于37 ℃振荡培养过夜，抽提质粒进行双酶切鉴定，酶切鉴定正确的克隆经测序证实，重组载体命名为pcDNA3.1(-) myc-his/Fra-1。

　　1.2.4 转染

　　按照脂质体LipofectamineTM试剂说明，通过脂质体法将pcDNA3.1(-) myc-his空载体和pcDNA3.1(-) myc-his/Fra-1重组载体转入MCF-7细胞。转染48 h后，加入800 μg/mL G418筛选两周。然后，进一步采用有限稀释法对转染的细胞进行克隆化培养。

　　1.2.5 RT-PCR分析转染的MCF-7细胞中Fra-1 mRNA表达

　　提取MCF-7/Fra-1细胞稳定表达克隆及空载体转染的MCF-7/pcDNA3.1细胞混合克隆总RNA，逆转录合成cDNA。PCR扩增Fra-1特异片段，以GAPDH为内参照，分析转染的MCF-7细胞中Fra-1的表达。Fra-1引物序列为：上游5′-GAGTAAGGCGCGAGCGGAACAA-3′;下游5′-TGGAACATAGAGGGAAAGGGGTCC-3′。GAPDH引物序列为：上游5′-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′;下游5′-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′。PCR反应参数：94 ℃变性5 min;然后94 ℃变性30 s、52 ℃退火50 s、72 ℃延伸1 min，进行28个循环;最后72 ℃延伸10 min。

　　1.2.6 Western blot分析MCF-7细胞中Fra-1蛋白的表达

　　提取MCF-7/Fra-1稳定克隆及MCF-7/pcDNA3.1混合克隆的细胞总蛋白，进行100 g/L SDS-PAGE，电泳结束后将蛋白电转印至硝酸纤维素膜。转印膜用含50 g/L脱脂奶粉的TBS-T室温封闭2 h，然后加入抗Fra-1抗体(用封闭液1∶500稀释)室温孵育2 h。用TBS-T洗膜3次，每次10 min，再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(用封闭液1∶5 000稀释)，室温孵育1 h。用TBS-T洗膜3次，每次10 min。用增敏化学发光底物试剂检测。同时检测MCF-7/Fra-1细胞及MCF-7/pcDNA3.1细胞GAPDH的表达作为内参照。

　　1.2.7 集落形成实验

　　将MCF-7/Fra-1和MCF-7/pcDNA3.1细胞悬于含10 mL/L FCS及200 μg/mL G418的DMEM培养液中，以每孔1 000个细胞接种于6孔板中，置于50 mL/L CO2、37 ℃孵箱培养2周后，姬姆萨染色，倒置显微镜下计数大于50个细胞的克隆数。每种细胞设3个平行对照孔。

　　1.2.8 细胞迁移实验

　　将1×105个MCF/Fra-1和MCF-7/pcDNA3.1细胞接种于Matrigel包被的96孔板，置于50 mL/L CO2、37 ℃孵箱培养24 h。用枪尖在单层细胞表面划一缺口，在含10 mL/L FCS及200 μg/mL G418的DMEM完全培养液继续培养，分别于划痕的0、9、18、27、36、45 h，在倒置显微镜下观察缺口的愈合情况，于各时间点取3个不同的视野照相，计算细胞覆盖的相对面积，对两种细胞在各时间点的平均相对覆盖面积进行统计学分析。

　　1.2.9 细胞黏附实验

　　在96孔培养板中每孔加入50 μL用DMEM 1∶8稀释的Matrigel，4 ℃过夜后，吸出Matrigel，每孔加入50 μL含10 g/L BSA的无血清DMEM培养液，37 ℃下孵育30 min，MCF/Fra-1和MCF-7/pcDNA3.1细胞用含10 mL/L FCS及200 μg/mL G418的DMEM培养液调整细胞浓度为1×105/mL，每孔取100 μL接种于Matrigel包被的96孔板，每种细胞各设6个复孔。置于50 mL/L CO2、37 ℃孵箱中培养1 h后，吸去培养液，并用PBS轻洗3次(每种细胞取3孔不洗作为参照)，按照MTT比色法测定各孔细胞的吸光度A值。根据MCF/Fra-1和MCF-7/pcDNA3.1黏附细胞和接种细胞A值，计算黏附细胞占接种细胞总数的百分比。计算公式为：黏附率=黏附细胞A平均值/接种细胞A平均值×100%。实验重复3次，对结果进行统计学分析。

　　1.3 统计学分析

　　集落形成实验用t检验，细胞迁移实验用单因素重复测量数据的方差分析。Matrigel黏附实验用单向方差分析。使用SPSS13.0统计软件进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 Fra-1基因的RT-PCR扩增结果

　　以MDA231细胞的cDNA为模板，成功钓取了约800 bp的全长Fra-1基因(图1)。

　　2.2 pcDNA3.1(-)myc-his/Fra-1重组质粒的鉴定结果

　　重组质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，10 g/L琼脂糖凝胶电泳显示，与插入片段大小一致的条带(图2)。对酶切鉴定正确的质粒进行测序，Fra-1序列与GenBank中公布的序列完全一致，无碱基突变。

　　2.3 转染的MCF-7细胞中Fra-1 mRNA的表达

　　通过RT-PCR分析筛选到的高表达Fra-1的稳定克隆和转染空载体混合细胞克隆中Fra-1 mRNA的表达水平，以GAPDH mRNA作为内参照。结果显示，该稳定克隆的Fra-1 mRNA表达水平明显高于转染空载体的对照细胞(图3)。将高表达Fra-1 mRNA的稳定克隆命名为MCF-7/Fra-1，将转染空载体的混合克隆命名为MCF-7/pcDNA3.1。

　　2.4 转染的MCF-7细胞中Fra-1蛋白的表达

　　Western blot结果显示，仅在MCF-7/Fra-1细胞中检测到Fra-1蛋白的表达，而在MCF-7/pcDNA3.1细胞中未检测到Fra-1蛋白表达(图4)。pcDNA3.1(-) myc-his载体携带有myc标签，用抗myc单克隆抗体，在MCF-7/Fra-1细胞中亦可检测到与Fra-1蛋白分子量大小一致的条带(图4)，表明MCF-7/Fra-1细胞所表达的Fra-1蛋白源自外源引入的Fra-1基因，Fra-1基因已成功转入MCF-7细胞。

　　2.5 集落形成

　　MCF-7/Fra-1细胞形成的集落明显多于MCF-7/pcDNA3.1细胞，约是对照细胞的两倍，差异具有统计学意义(P=0.001，表1)。提示Fra-1基因的导入可促进MCF-7细胞的增殖。表1 转染的MCF-7细胞的集落形成(略)

　　2.6 细胞迁移实验结果

　　结果显示，在不同的时间点MCF-7/Fra-1细胞均较MCF-7/pcDNA3.1细胞的覆盖面积多，具有显著的差异(图5)，在相同的时间点覆盖面积多，表明细胞迁移能力强。MCF-7/Fra-1细胞较MCF-7/pcDNA3.1细胞的迁移能力明显增强(表2，P=0.000)，证实Fra-1可促进MCF-7细胞的迁移能力。

　　2.7 MCF-7/Fra-1和MCF-7/pcDNA3.1细胞在Matrigel上黏附的细胞数比较

　　MCF-7/Fra-1细胞的黏附率为(73.0±12.1)%，MCF-7/pcDNA3.1细胞的黏附率为(34.0±8.18)%，两种细胞的黏附率具有显著性差异(P=0.01)，表明Fra-1可促进MCF-7细胞在Matrigel上的黏附能力。表2 MCF-7/Fra-1和MCF-7/pcDNA3.1细胞覆盖的相对面积(略)

　　3 讨 论

　　恶性肿瘤的侵袭和转移是一个多步骤、多因素参与的极其复杂的生物学过程，涉及肿瘤细胞、宿主细胞、细胞外基质等多种成分;涉及细胞黏附作用、细胞外基质降解、细胞的迁移等多种细胞功能的变化。在肿瘤侵袭和转移复杂的生物学过程中，阻断其中的某个阶段，可阻止转移灶形成。因此，寻找与肿瘤侵袭转移相关的分子具有重要的理论意义和现实意义。最近的研究发现，Fra-1作为转录因子Fos家族中的一员，其过表达与乳腺癌细胞系的高侵袭性有关。本实验构建了高表达Fra-1基因真核表达载体MCF-7/Fra-1，并筛选到稳定克隆，观察Fra-1对细胞增殖、黏附及迁移的影响，探讨Fra-1与乳腺癌侵袭转移的关系。

　　无限增殖性是肿瘤细胞的基本特征，也是肿瘤侵袭、转移的基础。集落形成实验是测定细胞群体中单个细胞增殖能力的有效方法，集落形成能力越高，代表其独立生存能力越强，形成转移灶的可能性就越大。我们在10 mL/L的血清培养条件下，显示MCF-7/Fra-1细胞较对照MCF-7/pcDNA3.1细胞的集落形成能力明显增强，约是对照细胞的2倍，表明Fra-1的过表达对单个细胞的增殖能力具有明显的促进作用，MCF-7/ Fra-1细胞增殖能力越强，其发生侵袭和转移的机会就越大。

　　肿瘤细胞的黏附特性在肿瘤细胞的侵袭和转移中起着极为重要的作用，肿瘤侵袭转移的过程包含黏附和去黏附两方面。在肿瘤侵袭转移的复杂过程中，肿瘤细胞需克服一系列组织屏障，这些屏障由细胞外基质(ECM)中的基底膜和间质基质构成，包括各型胶原、纤黏连蛋白(FN)、层黏连蛋白(LN)和蛋白多糖等成分。肿瘤细胞借助其表面受体与ECM成分黏附后，通过释放或诱导基质细胞分泌各种蛋白酶，降解不同的基质成分，为侵袭和转移打开通路。MatrigelTM 基底膜胶(MatrigelTM basement membrane matrix, BD)是从具有丰富胞外基质蛋白的鼠EHS(Engelbreth-holm-swarm)瘤中提取的，主要成分为层黏连蛋白、Ⅳ型胶原、硫酸肝素蛋白聚糖、巢蛋白(entactin and nidogen)及一些生长因子，可在体外模拟基底膜与肿瘤的相互作用。我们的研究发现，高表达Fra-1的MCF-7细胞在Matrigel上的黏附能力明显增强(P=0.01)，表明Fra-1能通过增强肿瘤细胞的黏附，促进肿瘤细胞的侵袭和转移。

　　细胞的迁移是肿瘤侵袭转移过程中的重要过程，肿瘤细胞的迁移能力与其侵袭和转移的潜能呈正相关。我们通过经典的划痕修复实验观察Fra-1对MCF-7细胞迁移力的影响。结果显示，转染Fra-1的细胞在Matrigel上的迁移能力明显增强(P=0.000)，表明Fra-1能够促进肿瘤细胞的迁移，可能在肿瘤细胞的侵袭及转移过程中发挥作用。

　　我们的研究结果表明，Fra-1与乳腺癌侵袭转移具有密切的关系，其过表达可促进肿瘤细胞的增殖，增加肿瘤细胞的黏附力及迁移能力。Fra-1作为一个转录因子，在肿瘤的侵袭和转移过程对肿瘤细胞的转移表型的影响与侵袭转移相关基因调控的具体机制，尚需进一步研究。

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