Nucleostemin基因特异性RNA干扰对胃癌细胞增殖和凋亡的影响

　　作者：郑学芝，胡静，孙卫，刘桂莲，刘晓霓，蔡子微 作者单位：黑龙江省牡丹江医学院：1. 生理学教研室;2. 组织胚胎学教研室;3. 重点实验室，黑龙江牡丹江 157011

　　【摘要】 目的 探讨应用RNA干扰技术抑制nucleostemin(NS)基因表达对胃癌SGC7901细胞株增殖和凋亡的影响。方法 阳离子脂质体法将构建好的NSsiRNA表达载体转染胃癌SGC7901细胞株，采用MTT法测试各组细胞增殖抑制率;RTPCR法检测各组细胞NS基因表达情况，流式细胞术检测细胞周期，AnnexinVFITC/PI法检测细胞凋亡率。结果 与对照组相比，S组细胞的增殖减慢，24、48、72h细胞增殖抑制率分别为53.21%、71.54%、87.47%;NS基因表达量下降，G0/G1期细胞百分率显著升高(58.34%)，S期细胞减少(20.68%)，细胞凋亡率增加(26.85%)。结论 RNA干扰技术可抑制胃癌SGC7901细胞株NS基因的表达，使细胞增殖减慢，细胞周期阻滞在G0/G1期，凋亡率增加。

　　【关键词】 RNA干扰;nucleostemin;胃癌;细胞增殖;凋亡

　　specific RNA interference in gastriccarcinoma cellsZHENG Xuezhi1, HU Jing2, SUN Wei1, LIU Guilian1, LIU Xiaoni1, CAI Ziwei3

　　(1. Department of Physiology; 2. Department of Histology and Embryology;

　　3. Key Laboratory, Mudanjiang Medical College, Mudanjiang 157011, China)ABSTRACT: Objective To investigate the effect on proliferation and apoptosis by RNA interference to inhibit Nucleostemin (NS) gene expression in gastric carcinoma SGC7901 cells. Methods The NSsiRNA expression vector was transfected into gastriccarcinoma cells with LipofectamineTM2000 reagent. Then we detected the cell proliferation inhibition ratio by MTT assay, the levels of NS gene expression in all groups by RTPCR, cell cycle by flow cytometry, cell apoptosis ratio by AnnexinVFITC/PI kit. Results Compared with that in the control group, cell proliferation in S group decreased; at 24, 48 and 72h the cell proliferation inhibition ratio was 53.21%, 71.54% and 87.47%, respectively, the level of NS gene expression reduced in S group. G0/G1 phase cell was 58.34%, S phase cell was 20.68%, and the cell apoptosis was 26.85%. Conclusion RNA interference could substantially inhibit NS gene expression in gastric carcinoma SGC7901 cells, decrease cell proliferation, arrest cell cycle and increase apoptosis ratio.

　　KEY WORDS: RNA interference; nucleostemin; gastric carcinoma; cell proliferation; apoptosis

　　NS基因是新发现的一种蛋白质核因子。该基因在人类的数种肿瘤细胞中表达丰度很高，但在分化的成体组织中却不表达。研究者认为NS基因有可能决定干细胞和肿瘤细胞的自我复制能力[1]。随着研究的深入，NS基因在调节干细胞和肿瘤细胞的增殖和分化中的作用引起了愈来愈多的关注，有可能是理想的肿瘤标志物及基因免疫治疗的靶点。本实验采用RNA干扰技术，以胃癌SGC7901细胞株中NS基因作为靶点来研究胃癌细胞增殖及凋亡情况的变化。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 胃癌SGC7901细胞株购自中科院上海细胞所。PCDNA4/CNSsilencer质粒[2]由本室构建并保存。RPMI 1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、MTT、DMSO购自Gibco公司。LipofectamineTM2000 Reagent、Zeocin购自Invitrogen公司。AnnexinVFITC/PI试剂盒购自BD公司。RTPCR试剂盒购自TaKaRa公司。引物合成及PCR产物测序由上海申能博彩生物科技有限公司完成。

　　1.2 细胞培养和转染 胃癌SGC7901细胞培养于含100mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养基中，置于37℃、50mL/L CO2潮湿空气的培养箱内培养，48h细胞贴壁后，更换培养液，然后2～3d传代1次，以维持细胞处于对数生长期。转染前1d将细胞接种到24孔板上，按每孔2×105个细胞传代。转染方法按LipofectamineTM2000 Reagent使用说明步骤进行。

　　1.3 单细胞来源细胞克隆的筛选及鉴定 PCDNA4/CNSsilencer质粒和空载体PCDNA4/Cvector质粒转染胃癌SGC7901细胞后2～3d(分别命名为S组和V组)，开始使用抗生素Zeocin(200mg/L)筛选，单克隆形成后进行扩大培养，未转染的胃癌SGC7901细胞作为空白对照(N组)。以载体上Zeocin基因为目的基因，通过PCR方法鉴定细胞克隆是否外源基因整合阳性。其引物序列为：上游引物5′ATGGCCAAGTTGACCAGTGC3′，下游引物为5′TCAGTCCTGCTCCTCGGCCA3′。PCR反应条件为：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，PCR产物大小约370bp，用PCR产物做琼脂糖凝胶电泳。

　　1.4 细胞的形态学观察 倒置显微镜下观察各组细胞形态学的变化情况。

　　1.5 MTT比色法测定细胞增殖抑制率 在96孔培养板上接种3组细胞，每组24复孔，每孔以1×103细胞浓度进行接种，分别于24、48、72h三个时间段进行MTT测定，每次每组测定8复孔。以培养液做空白对照并调零，用酶标仪测定490nm处的吸光度值(A值);测3次，取平均值。

　　细胞增殖抑制率=1-细胞存活率=(1-实验组A值/空白对照组A值)×100%

　　1.6 各组NS基因表达水平的检测 用RTPCR方法验证各组细胞NS基因表达丰度变化。参照Genbank中NS和GAPDH的基因序列及参考文献[3]，设计引物序列如下：NS基因扩增产物约570bp，上游P1：5′ATGAAAAGGCCTAAGTTAAAGAAAGC3′，下游P2：5′GCTCTCCAAATTCTCCTTTGGTA3′;

　　GAPDH基因扩增产物长度约280bp，上游P3：5′GGTGGACCTGACCTGCCGTCTAGA3′，下游P4：5′TTACTCCTTGGAGGCCATGTGGG3′。PCR反应条件为94℃ 5min→(94℃ 30s→50℃ 30s→72℃ 30s)30 Cycles→72℃ 10min。

　　1.7 细胞周期的检测 将培养48h后的各组细胞制成单细胞悬液，用700mL/L乙醇处理过夜，碘化丙啶染色，取1×106细胞/mL，用流式细胞仪检测细胞周期分布;每组实验重复3次。

　　1.8 细胞凋亡的检测 按AnnexinVFITC/PI凋亡试剂盒说明分别处理各组细胞，取1×106细胞/mL，30min内用流式细胞仪检测细胞凋亡率。每组实验重复3次。

　　1.9 统计学分析 实验数据以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS 11.5 for windows 软件包，进行方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 PCR法鉴定S组和V组的细胞克隆 将获得的S组和V组细胞克隆扩大培养后，用PCR方法进行外源基因整合的阳性鉴定，N组细胞作为对照。PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果显示，S组和V组细胞克隆皆有370bp的产物片段，而N组细胞没有该产物片段(图1)。

　　2.2 各组细胞的形态学变化 与V组和N组比较，S组胃癌细胞的肿瘤生物学行为发生了显著的变化，细胞体积变小并趋向于均一，胞浆丰富，胞质中颗粒增多，核质比变小，胞膜边缘突起增多，可见细胞碎片。

　　2.3 MTT比色法测定细胞的增殖能力 细胞培养24、48、72h时后，S组细胞的增殖抑制率分别为53.21%、71.54%、87.47%;V组细胞的增殖抑制率分别为4.91%、5.27%、6.14%，S组和V组相比差异具有显著性(P<0.01，表1)。

　　2.4 各组肿瘤细胞NS基因的表达水平 S组肿瘤细胞NS基因表达水平明显低于对照V组和N组的肿瘤细胞(图2)。表1 各组细胞不同时间的细胞增殖抑制率

　　2.5 各组细胞周期分布及凋亡情况 G0/G1期细胞百分率显著增加，S组与V组和N组相比差异具有显著性(P<0.05);S期细胞百分率降低(P<0.05)。说明PCDNA4/CNSsilencer转染胃癌SGC7901细胞后出现了G0/G1阻滞。AnnexinVFITC/PI结果显示S组细胞凋亡率增高，与V组和N组相比差异具有显著性(P<0.01，表2)。表2 各组胃癌细胞的细胞周期分布和凋亡情况

　　3 讨 论

　　胃癌是人类常见的恶性肿瘤之一，居肿瘤病死率的第2位。因此，急需一种有效的方法来提高胃癌患者的生存率。NS基因是一种p53结合蛋白，位于人类3号染色体上，能表达550个氨基酸，主要存在于核仁中，在核质中也有低量表达;在干细胞处于早期多潜能状态时该基因的表达丰度很高，而在分化开始时，这个基因的表达却突然几乎完全消失;NS基因可能充当调控正常干细胞和癌细胞增殖的双面角色，NS基因可能是干细胞和肿瘤细胞通过G2/S检验点的特异性调控因子[1]。NS基因通过控制核醣体的合成和p53功能来调节细胞的增殖和生长[4]。NS蛋白含有与p53结合的区域,并且在核质中含有NSp53的蛋白复合体[1]。研究表明多种肿瘤组织中都有NS基因的表达，运用RNAi机制可使宫颈癌Hella细胞和食管癌Eca109细胞的增殖被抑制[56];NS基因表达下调可导致细胞离开细胞增殖周期而发生分化[7];NS蛋白阳性表达率与食管鳞状细胞癌的组织学分级、浸润深度及淋巴结转移有关[8]。

　　本实验结果显示，与对照组V和N组比较，S组胃癌细胞的肿瘤生物学行为发生了显著的变化，细胞体积变小并趋向于均一，胞质丰富，胞质中颗粒增多，核质比变小，胞膜边缘突起增多，可见细胞碎片。MTT法显示S组细胞的增殖速率明显低于V组细胞，24、48、72h细胞增殖抑制率分别为53.21%、71.54%、87.47%，S组和V组相比差异具有显著性(P<0.01);随转染时间的延长增殖抑制效果加强。RTPCR产物电泳结果显示S组肿瘤细胞中NS基因表达量下降。流式细胞术显示G0/G1期细胞百分率显著升高，S期细胞百分率降低(P<0.05);细胞凋亡率增加(P<0.01)。

　　本实验结果说明NS基因对细胞周期的调控主要体现在G0/G1期向S期的转变过程。运用RNA干扰技术沉默NS基因的表达导致胃癌细胞增殖减慢，细胞周期阻滞在G0/G1期，凋亡增加， 从理论上有望为将来的基因治疗提供靶向，具有重要的临床意义。NS基因有可能成为肿瘤基因治疗的新靶点。但是，NS蛋白活动的精确分子机制尚不完全清楚。这方面的工作仍然需要大量的实验去证实。

　　【参考文献】

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　　[5]郑学芝，刘桂莲，李丽，等. RNA干扰Nucleostemin基因对人食管癌Eca109细胞株增殖影响的实验研究 [J]. 肿瘤防治研究, 2007, 34(2):103106.

　　[6]LIU SJ,CAI ZW, LIU YJ, et al. The effect of knockingdown Nucleostemin gene expression on the in vitro proliferation and in vivo tumorigenesis of Hella cells [J]. J Exp Clin Cancer Res, 2004, 23(3):207216.

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　　[8]张功员，尹磊，李晟磊，等. 食管鳞状细胞癌组织中核干细胞因子蛋白的表达 [J]. 郑州大学学报(医学版), 2007, 42(6):10881090.