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《肿瘤学》

DNMT1、βcatenin和PGSK3β在结肠癌组织中的表达

发表时间:2010-06-09  浏览次数:401次

  作者:魏永长,贺大林,赵佳辉,白纪蓉 作者单位:1. 西安交通大学医学院第一附属医院肿瘤内科;2. 西安交通大学医学院第一附属医院泌尿外科,陕西西安 710061;3. 首都医科大学附属北京安贞医院泌尿外科,北京 100026; 4. 西安交通大学医学院第二附属医院普外科,陕西西安 710004

  【摘要】 目的 探讨DNA甲基转移酶1(DNMT1)、β连环素(βcatenin)和磷酸化糖原合成酶激酶(PGSK3β)在结肠癌中的表达及其与肿瘤分化程度和淋巴结转移等的关系。方法 采用荧光定量PCR检测62例原发性结肠癌患者癌组织及21例正常大肠黏膜组织中DNMT1、βcatenin和GSK的表达,采用Westernblot方法验证蛋白的表达情况。结果 结肠癌组织中DNMT1、βcatenin和PGSK3β表达程度显著高于正常组织。DNMT1在低分化程度的癌组织间相对含量高,βcatenin在肿瘤的不同分化程度及有无淋巴结转移的癌组织间相对含量的差异有统计学意义,而PGSK3β的组间比较无显著性差异。结论 DNMT1、βcatenin和PGSK3β的活性改变与结肠癌有一定的相关性。

  【关键词】 DNA甲基转移酶1;磷酸化糖原合成酶激酶;β连环素;结肠癌

  PGSK3β in colon carcinomaWEI Yongchang1, HE Dalin2, ZHAO Jiahui3, BAI Jirong4

  (1. Department of Medical Oncology, the First Affiliated Hospital, Medical School of

  Xian Jiaotong University, Xian 710061; 2. Department of Urinary Surgery,

  the First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061;

  3. Department of Urinary Surgery, Beijing Anzhen Hospital of the Capital University of

  Medical Science, Beijing 10026; 4. Department of General Surgery, the Second Affiliated

  Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)ABSTRACT: Objective To examine DNMT1, βcatenin and PGSK3β expressions in tissues of colon carcinoma compared with tumor clinicopathological parameters including differentiation and metastasis. Methods SYBR Green realtime PCR and immunoblotting method were used to detect these gene expressions in 62 tissues of colon carcinoma and 21 tissues of normal colon. Results Overexpressions of DNMT1, βcatenin, and PGSK3β were found in colon carcinoma tissues. The expression of DNMT1 was found to be higher in poorly differentiated tissues. The results also demonstrated statistical significance in the expression of βcatenin involving differentiation and metastasis, but no statistical significance in the expression of PGSK3β. Conclusion These results show that DNMT1, βcatenin and PGSK3β expressions are regulated throughout colon cancer progression.

  KEY WORDS: DNA methyl transferase 1 (DNMT1); phosphoglycogen synthase kinase 3 beta (PGSK3β); βcatenin; colon carcinoma

  结肠癌的发生发展是多步骤、多基因参与的结果,在此过程中可能涉及到多个途径的分子改变[1]。GUZ报道[2]结肠癌的发生不但与DNA损伤有关,而且异常甲基化影响基因的表达可能也是一个重要因素。此外,Wnt信号传导通路是一种既可影响结肠癌基因表达又可影响细胞迁徙的信号通路[34]。βcatenin是该通路中重要的信号传递子,其在胞浆内的稳定、积累及进核是Wnt信号传递的重要步骤[5]。本研究采用荧光定量PCR和Westernblot检测DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1, DNMT1)、β连环素(βcatenin)和磷酸化糖原合成酶激酶 (phosphoglycogen synthase kinase3beta, PGSK3β)在结肠癌中的表达,探讨其与肿瘤分化程度和淋巴结转移等的关系。

  1 材料与方法

  1.1 研究对象 选自2006年3月至2007年12月间在西安交通大学医学院第一附属医院和第二附属医院住院的初发结肠癌患者62例,经手术切除后病理确诊为结肠腺癌。其中男38例,女24例,年龄28~80(57.88±11.65)岁。入组前心、肝、肾功能基本正常,既往无特殊病史。正常大肠黏膜21例,其中男性12例,女性9例,平均年龄55.62岁。

  1.2 荧光定量PCR 抽提细胞和组织总RNA,紫外吸收测定法检测RNA浓度和纯度。变性琼脂糖凝胶电泳,紫外透射光下观察并拍照。5μg总RNA经逆转录合成cDNA(Promega),逆转录反应为70℃干浴3min,37℃ 1h,95℃干浴3min,cDNA溶液储存于-80℃备用。Realtime PCR扩增试剂盒来自广东达晖生物公司。βactin的引物系列:上游引物5′CCTGTACGCCAACACAGTGC3′,下游引物5′ATACTCCTGCTTGCTGATCC3′,扩增片段长度为211bp;DNMT1的引物系列:上游引物5′CGATGAGGAAGTCGATGATAACAT3′,下游引物5′ATGCGATTCTTGTTCTGTTTCTTCT3′,扩增片段长度为90bp;βcatenin的引物系列:上游引物5′AGGAAGCTTCCAGACACGC3′,下游引物5′CGCACTGCCATTTTAGCTCC3′,扩增片段长度为280bp;PGSK3β的引物系列:上游引物F:5′CCTTAACCTGGTGCTGGACT3′下游引物5′AGCTCTGGTGCCCTGTAGTA3′,扩增片段长度为300bp。反应参数为:93℃预变性3min,93℃变性1min,55℃退火1min,40个循环,DNMT1、βcatenin和PGSK3β PCR扩增时需72℃延长7min。具体操作按说明书进行。反应的PCR产物(ABI GeneAmp5700 Realtime PCR仪)进行琼脂糖凝胶电泳,GoldViewTM染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

  1.3 免疫印迹鉴定DNMT1、βcatenin和PGSK3β的表达 取适量组织匀浆,用蛋白裂解液裂解后提取蛋白,用考马斯亮蓝G250定量,最后加入6×上样缓冲液,100℃沸水中变性10min。按每孔30μg上样,100g/L SDSPAGE 120V电压下分离,再用30V电压将凝胶上的蛋白湿转至硝酸纤维素膜上。5g/L脱脂奶粉将膜封闭2h后,按照相对分子质量标记裁剪各目的蛋白条带,对应加入一抗,羊抗人DNMT1多克隆抗体(Santa Cruz, USA)工作浓度为1∶200,兔抗人βcatenin和PGSK3β多克隆抗体(SAB, USA)工作浓度为1∶1000,分别反应12h,用TBST缓冲液洗涤6次,每次10min。洗涤完毕加入辣根过氧化物酶(北京中山生物技术公司)标记的二抗,兔抗羊和羊抗兔IgG工作浓度均为1∶5000,分别反应1h,用上述方法洗涤后再用电化发光(electrochemiluminescence, ECL)作用1min,在暗室中用X胶片显影,结果采用凝胶图像分析仪进行分析。所有内参对照均使用GAPDH(鼠抗人IgG,工作浓度为1∶10000)。

  1.4 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件,原始数据组间方差齐时用单因素方差分析(oneway ANOVA),组间比较用Dunnettt检验,检验水准为α=0.05;组间方差不齐时用KruskalWallis H检验,组间比较用MannWhitney U检验,检验水准为α=0.05。

  2 结 果

  2.1 DNMT1、βcatenin和PGSK3β表达的比较 经统计分析,结肠癌组织中DNMT1、βcatenin和PGSK3β表达程度均高于正常组织。DNMT1在低分化程度的癌组织间相对含量高,在相同肿瘤分化程度的癌组织间相对含量有一定差异。βcatenin在不同肿瘤分化程度及有无淋巴结转移的癌组织间相对含量的差异有统计学意义,而PGSK3β的组间差异不明显(表1)。表1 结肠癌基因表达率与临床病理特征之间的关系

  2.2 Western blot检测目的基因的表达 结肠癌组织中DNMT1、βcatenin和PGSK3β表达程度均增高。DNMT1在正常组织中可见弱表达,在不同癌组织样本中表达呈现不均一性,βcatenin和PGSK3β在正常组织中未见表达(图1)。

  3 讨 论

  肿瘤细胞的总体甲基化水平低于正常细胞,但通常处于非甲基化状态的CpG岛(位于广泛表达基因启动子附近)却常为甲基化状态,其相关基因的表达亦被关闭。DNA甲基化作用是在各种生物体内普遍存在的一种基因修饰作用,在基因表达过程中起重要调控作用。DNMT1是人体内最重要的甲基转移酶,维系着新合成的DNA子链的甲基化[6]。DNMTI是DNMT的1个亚型,该基因编码1495个氨基酸,相对分子质量为117ku,其羧基端为保守的催化甲基化反应结构域。荧光原位杂交显示,人DNMTI定位于19p13.22p13.3。在肿瘤细胞中,抑癌基因的高度甲基化、细胞的异常增殖分化等均与DNMT1活性增高有关。文献报道DNMT1的高表达与非小细胞肺癌[7]、白血病[8]和子宫内膜癌[9]等的发生、耐药和预后有着密切的关系。MISHRA等[10]通过分子生物学实验证实DNMT1高表达的细胞株对依托泊甙和顺铂等耐药,通过降低其表达可增强细胞毒药物的疗效。本实验结果也进一步证实DNMT1在结肠癌患者中表达增加,因此有望通过抑制DNMT1的活性来恢复抑癌基因的表达,并在一定程度上逆转结肠癌的恶性表型。

  βcatenin基因定位于人染色体3p21.3,其mRNA长度为3362个核苷酸残基,相对分子质量为90ku。βcatenin既是细胞间黏附连接的主要结构成分,又是信号通路的中枢成分,它的异常改变在肿瘤浸润、转移过程中发挥着重要作用[5]。GSK3β是一个多功能的丝氨酸苏氨酸类激酶,在真核生物中普遍存在,其基因定位于人染色体3q13.3。PGSK3β相对分子质量为46ku,其活性受磷酸化和非磷酸化机制调节,其生物学活性与磷酸化密切相关。它通过磷酸化调节肿瘤细胞内Wnt、Ras/Raf/丝裂原活化蛋白激酶和核因子κB等通路中的关键因子的活性,调控这些信号通路的活化,对肿瘤细胞的蛋白表达、增殖和凋亡产生重要的影响。目前,研究认为GSK3β是βcatenin的主要负调控因子,该蛋白的失活使胞内游离增多,变异的βcatenin蛋白积累并进入细胞核,进入核内与转录因子结合,启动转录过程,引发了细胞循环周期失控,加快了肿瘤增殖。BAN等[11]研究表明,PGSK3β在肝癌组织中表达上调,且与βcatenin的累积相关。SHAKOORI等[12]发现在体外通过药物抑制剂或RNA干扰靶向降低GSK3β的活性可以使结肠癌细胞的增殖衰减并诱导凋亡。本研究显示,正常组织中βcatenin不表达,随着结肠癌分化程度增高,其表达率下降,这与CHANG等[13]的研究结果相似;PGSK3β在正常组织中不表达,在结肠癌组织中表达增强,同时发现βcatenin和PGSK3β的蛋白表达与结肠癌的分化程度以及淋巴结转移指标等有关,表明Wnt信号传导中βcatenin和PGSK3β的表达与癌细胞的增殖、分化和疾病预后有密切的关系。

  综上所述,多种基因改变参与结肠癌患者的发生发展过程。本研究证实DNMT1、βcatenin和PGSK3β活性改变与结肠癌有一定的相关性。

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