RNAi与肿瘤的研究

作者：倪志超, 付立奎，段昕所   

作者单位：1.承德医学院06级研究生， 河北 承德 067000 2.河北省承德市双桥区妇幼保健所， 河北 承德 067000 3.承德市医学院附属医院 河北 承德 067000 【关键词】  RNAi 肿 瘤　　RNAi干扰(RNA interference,RNAi)是一种生物进化过程中出现的高度保守现象,表现为转录后的基因沉默,是近年来研究基因功能的新方法［1］。肿瘤的发生是基因参与并经多阶段演进而形成的基因疾病，RNAi现象的发现为肿瘤的基因研究治疗提供了一种新的方法,通过RNAi技术抑制基因的表达已成为肿瘤研究及治疗的新策略。　　１  RNAi简介　　1998年Fire等［2］发现将很少量的双链RNA(dsRNA)注入秀丽新线虫(C elegans)体内,即可特异、高效地阻断/抑制与dsRNA同源的基因表达,其阻断/抑制率比纯化后的反义RNA技术高若干个数量级别。之后,学者们在真菌和哺乳类动物细胞中均发现RNAi现象存在。随着研究的深入［3］,RNAi技术在细胞遗传学,基因功能研究及肿瘤的基因治疗等方面显示出其强大的潜力及应用前景。　　RNAi引发基因沉默的具体机制尚未完全清楚。目前比较公认的是［4］,由外源导入的或由转基因、病毒感染、转座子等转录产生的dsRNA与胞浆内的Dicer酶结合。Dicer酶具有RNA酶Ⅲ结构域和dsRNA结合位点,以ATP依赖方式逐步切割结合dsRNA,产生21～25bp的小片段dsRNA,即小片段干扰RNA(small inter- fering RNA,siRNA)。siRNA中的一条链与蛋白复合物结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC可专一性地与靶向的mRNA特异性结合并切割，切下的靶mRNA片段进一步由细胞内RNA酶降解清除。另一方面，解链的siRNA可直接与特异的mRNA结合，在RNA依赖性RNA多聚酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRP)作用下可形成新的dsRNA，新的dsRNA又被Dcer识别而被切断形成siRNA，如此逐级放大式的作用形成大量新siRNA，从而使RNAi在短时间内达到高效地抑制特异mRNA的表达。      　　RNAi的应用主要通过体外合成构建载体或表达元件实现目的基因的沉默。体外合成主要有化学合成，体外转录和酶切长链dsRNA，构建载体可用质粒和病毒。诱导RNA干扰有很多种方法，各有其优缺点：①化学合成法,应用广泛但成本较贵，体外合成的长为21nt，3’端带有2个突出碱基的小干扰RNA较其它形式合成的RNA具有最大效率的降解靶mRNA的效果，一个碱基的错配，能明显的降低干扰的效率［5］；②siRNA表达载体，在质粒或病毒载体中，利用RNA聚合酶启动子U6或T7分别控制正义链和反义链的合成并在细胞内退火形成双siRNA，或在聚合酶启动子下游设计带发夹结构的表达单位，表达后自身退火形成双链siRNA［6］③利用载体表达长的dsRNA，多用于果蝇、线虫等低等生物中，在体内表达后被Dicer切割成21－23nt的小干扰RNA，引发特异地基因表达抑制；或在体外利用Dicer、RNase III切割dsRNA，产生siRNA，纯化后使用；长的dsRNA在哺乳动物细胞中能激发非特异性反应；但已有研究表明在鼠胚胎或胚胎细胞系中，长500nt的dsRNA也能诱发特异的基因沉默［7］。      　　siRNA 的设计是RNAi实验成败的关键。选择AUG起始密码子下游75位碱基开始寻找AA + N19 + UU 或AA + N19 序列,N19 指的是长19个碱基的任意序列,被选择序列的G + C 比例应在30%～70%［8］，尽量避免3 个以上连续出现的相同核苷酸。最后通过BLAST 分析,排除那些与其他基因有明显同源性的靶位点(连续16个以上碱基相同)，如能根据mRNA二级结构的区域设计则更佳,目前已有多家生物公司提供在线免费设计服务。Reynolds等［9］针对2个基因设计了180种不同的siRNA ,观察它们对目的基因mRNA的靶定能力,通过分析归纳出siRNA设计的8 条规则: ① GC含量30 %～52 %;②15～19位上至少有3个A/ U;③序列没有内部重复序列;④第19位上为A；⑤第3位上为A ;⑥第10位上为U;⑦第9位上不能为G/ C;⑧第13位不能为G。此外,避免RNA酶污染,选择高效转染试剂,纯化合成的siRNA 都可能提高其沉默效率。

　将制备好的siRNA,siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种［10］①磷酸钙共沉淀：将氯化钙，RNA或DNA和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA混合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入靶细胞的细胞质。②电穿孔法：通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。③DEAE-葡聚糖和polybrene:带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚糖复合物和带负电的DNA分子使得DNA结合在细胞表面。通过使用二甲基亚砜（DMSO）或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。④机械法：比如显微注射和基因枪。显微注射使用一根细针头将DNA,RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高microprojrctile将大分子导入细胞。⑤阳离子脂质体试剂：在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。      　　RNAi的效果分析［11］，RNAi的分子的检测主要通过mRNA和蛋白两个方面进行检测。mRNA可以采用RT-PCR，荧光定量PCR,Northern杂交等，通过信号强弱判断目的基因的沉默效果。蛋白检测可通过Western杂交，ELISA。RNAi最大以及最终的效果是细胞的代谢过程，生理生化系数等表型参数发生明显的变化。      　　近几年来RNAi研究取得了突破性进展，被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首［12］。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能及恶性肿瘤的基因治疗领域。

　　２  RNAi在肿瘤发生发展机制研究中有广泛应用      　　RNA干预技术(RNAi)已被应用于探寻与癌症有关的基因了。RNAi技术通过关闭某一个基因,使之具有明显的特殊性,这样,就能了解基因的行为,从而发现它是怎样诱发或抑制某一种癌症的。      　　透明质酸酶(hyaluronidase,Hyase)是一种细胞外基质降解酶，它可以降解HA刺激血管生成又能降低细胞间的粘附促进肿瘤细胞的迁移。谭金祥等人［13］设计了以Hyase基因HYALL为靶标的siRNA,由Ambion公司合成一对有效siRNA，正义链序列为5-GGVVAUCAAGGAGUAUAUGtt-3,反义链5-CAUAUACUCCU UGAUGGCCtg-3,转染人乳腺癌细胞株MDA-MB-231,48h后RT-PCR示mRNA表达水平(58.5%±6.6%)较阴性对照组（90.0%±3.1%）明显下降，癌细胞侵袭力实验穿膜细胞数（90.0 ±6.2）明显少于阴性对照组（357.0±17.1），试验结果表明Hyase的水平与肿瘤细胞的生长侵袭能力正相关，它在肿瘤发生过程中扮演重要角色。      　　发展中国家食管鳞状上皮细胞癌发病率十分高，尽管该病死亡率很高，但相关分子生物学机制仍然知之甚少。生长相关致癌基因（GRO），这种CXC趋化因子超家族的一员，在感染和伤口愈合中扮演重要的角色，研究发现CXC趋化因子与肿瘤发生，血管生成及肿瘤转移等关系密切。尽管在几种肿瘤研究中报道GRO表达升高，但关于食管癌的研究还很少。Bo Wang,和Denver［14］ 检测了食管鳞状细胞癌组织和相临正常组织中GROαGROβ两种生长相关致癌基因以及它们的受体CXCR2发现癌组织中GROαGROβCXCR2均过度表达。随后用RNAi技术将针对GROαGROβ的特异性小片段RNA转染进癌细胞株,对GRO行基因敲除,RT- PCR 显示GROα,GROβ基因表达减低,癌细胞株增殖减少20%～50%.实验结果表明GRO在食管鳞状上皮细胞癌自分泌生长增殖中处于重要一环。      

RNAi也可特异抑制细胞周期相关基因。CyclinE是细胞从G1期到S期转变的关键分子，在许多肿瘤细胞中高表达，针对CyclinE的siRNA可特异干扰CyclinE的表达，并使肿瘤细胞停滞于G1期［15］ Gp210是核孔复合体上的一个整合膜蛋白，在细胞分裂（M期）中对细胞质和细胞核间的相互沟通起着重要作用。Cohen等［16］将Gp210siRNA导入Hela细胞后，发现在5d内超过60%的肿瘤细胞发生死亡，说明Gp210是分裂细胞存活的一个必要基因。       　　耐药基因在肿瘤化疗抵抗中起着重要作用。MDR1是一种多药耐药基因。多药耐药(multidrug resistance , MDR)是指肿瘤细胞对化疗药物的原发性或继发性抵抗现象,许多肿瘤在化疗前即有MDR1的高表达。Nieth 等［17］将MDR1siRNA转染胰腺癌和胃癌两个细胞系,发现MDR1mRNA和蛋白均被显著抑制（达91%），且对柔红霉素的耐药分别被降至89 %和58 %。结果证明, MDR1在肿瘤耐药机制中有重要作用，应用RNAi技术逆转MDR可恢复对化疗药物的敏感性。                                    　　３  RNAi在肿瘤治疗及研究中的应用      　　应用RNAi技术抑制肿瘤细胞中一些癌基因的表达和细胞中的血管生长因子，可以抗肿瘤增生和抗肿瘤转移，以达到治疗肿瘤的目的。

　　癌基因bcr-acl可表达于慢性粒细胞性白血病（chronic leukemic，CML）和急性淋巴细胞白血病，Scherr M［18］已利用化学合成的、针对bcr-acl癌基因的siRNA能显著减少 CML病人中bcr-acl阳性细胞及原始细胞中的bcr-acl mRNA的表达约87%。通过siRNA作用，可致 bcr-abl阳性细胞及正常CD 34 +细胞中的bcr-acl蛋白及核纤素A/C的表达减少80%，抑制bcr-acl依赖性的bcr-acl阳性细胞增生，从而特异、高效干扰造血细胞中癌融合基因的表达，抑制肿瘤生长。      　　尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)是肿瘤侵袭和转移过程中降解细胞外基质的蛋白水解酶系统的重要成分之一，破坏细胞外基质和基底膜，利于肿瘤的侵袭和转移在肿瘤转移中发挥重要作用。Salvi［19］等通过RNAi技术研究uPA在肝癌浸润性中的作用，选取高表达uPA的肝癌细胞系SKHep1c3,通过转染针对uPA 基因的特异性siRNA，抑制uPA 基因表达，结果显示转染的细胞uPA表达持续下降，同时其迁移能力，浸润性和增殖力下降。Salvi博士认为利用RNAi抑制uPA表达，有望成为新型的肝癌基因治疗手段。      　　S期激酶相关蛋白2（S-phase kinase-associated protein2，Skp2）基因是潜在的癌基因，其表达产物Skp2 蛋白是泛素化的必要条件，它还参与P27 蛋白的降解。在多种癌细胞包括口腔鳞状细胞癌细胞中可观察到由于P27 蛋白过度降解而导致其低表达，但Skp2 蛋白过度表达。Shojiro Kitajima等人 ［20］构建Skp2基因、特异性siRNA表达质粒,转染了口腔鳞状细胞癌细胞，发现转染siRNA表达质粒的细胞中Skp2蛋白表达减少而P27 蛋白表达增加,且P27蛋白比对照细胞中的更稳定;Skp2基因siRNA在体内外均抑制了癌细胞的增殖，因此Skp2 基因可以成为口腔鳞状细胞癌基因治疗的靶点。                                           　　透明细胞癌在卵巢肿瘤中发生率较低而恶性度较高,肝细胞刺激因子（HNF）-1pate是序列特异性调控转录因子,它的mRNA和蛋白水平在透明细胞癌的表达上调,免疫组化分析表明,肝细胞刺激因子-1b 的表达和透明细胞癌密切相关。Akria Tsuchiya等［21］利用RNAi技术抑制该基因在卵巢透明细胞瘤中的表达。他们将构建好的siRNA 分别转染到卵巢透明细胞瘤细胞TOV221、JHOC25细胞株后用实时RT-PCR分析,结果表明mRNA 水平分别降低27% ～45%和50% + 12% , 同时TUNEL分析表明, RNA干扰导致HNF-1B表达水平降低并诱导肿瘤细胞凋亡，研究结果显示HNF基因可以作为靶基因来治疗透明细胞瘤。

　４  前景与展望      　　近十年来,人们对RNAi 的不断研究,使人们对RNAi 有了更进一步的认识,并在RNAi 应用领域取得了较大进展,渐渐看到了RNAi 广阔的应用前景,尤其在基因、蛋白质功能的研究中［22］,人们对RNAi技术应用于恶性肿瘤的治疗寄予厚望。RNAi技术可用于抑制癌基因表达，恢复正常基因的功能，增加肿瘤细胞对现有治疗手段的敏感性，还能筛选基因治疗作用靶点，是研究肿瘤发生发展及治疗的有效手段。但是RNAi 是否存在别的反应途径? 细胞如何识别外源性dsRNA ? RNAi在细胞间传递的分子机制是什么?能否作为治疗手段安全地应用于人体等问题的解决仍需要人们进一步研究。许多体外实验发现siRNA作用于培养的肿瘤细胞中有明显的治疗效果，但在体实验的研究还很少有成功报道。主要是因为siRNA在体内易被降解,转染效率及靶向性均较低,作用的时间短,前述传统方法所产生的抑制效应都是很短暂的,一般有效期只有一周左右。基于这个问题，目前设计了一些专门用来转录shRNA（short harpin RNA，siRNA前体）的RNAi载体，包括质粒载体及各种病毒载体（逆转录病毒、腺病毒和慢病毒）。利用RNAi载体可达到持久、稳定沉默靶基因的效果。但目前载体的稳定性以及安全性问题还有待解决。因此,发展更多效率高、稳定好、可调控的RNAi 载体是目前进行RNAi肿瘤基因治疗的一个重要方向，同时要寻找最佳RNAi作用靶点，以增强RNAi的作用［23］。随着对RNAi的进一步认识和RNAi技术的不断改进，RNAi技术将被更广泛地应用，相信不久的将来, RNAi技术将会逐渐完善,必将为肿瘤的研究和治疗带来深刻的革命。

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