生存素在5氟尿嘧啶诱导人绒癌细胞株JAR凋亡中的作用

作者：王涛作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安 710061   【摘要】  目的 探讨生存素(survivin)在化疗药物5氟尿嘧啶(5Fu)诱导的人绒癌细胞株(JAR)凋亡中的作用。方法 用JAR细胞株进行培养传代，以不同浓度5Fu作用于JAR细胞，MTT方法观察5Fu对JAR细胞生长的抑制情况，流式细胞仪检测细胞凋亡率，用逆转录聚合酶链(RTPCR)和免疫印迹技术(Westernblot)方法检测survivin基因和蛋白的表达。结果 ①5Fu对JAR细胞的生长具有抑制作用，并有浓度和时间的依赖性；②5Fu诱导JAR细胞凋亡，凋亡率随浓度而增加；③5Fu作用后survivin基因和蛋白表达减少，随浓度增加而减少。结论 5Fu可能是通过降低survivin表达水平，诱导JAR细胞凋亡。 【关键词】  5Fu 人绒癌细胞 凋亡 survivin　　Effect of survivin on choriocarcinoma cell　JAR apoptosis induced by 5fluorouracil　　Wang Tao, An Ruifang, Wang Shu, Xue Yan　　(Department of Obstetrics and Gynecology, the First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)　　ABSTRACT: Objective  To study the role of survivin in choriocarcinoma cell JAR apoptosis induced by 5fluorouracil (5Fu). Methods  The choriocarcinoma cell JAR strain was chosen in this study. The inhibitory effects of chemotherapeutical drug 5Fu on JAR strain were assayed with MTT method. Apoptosis was detected by AnnexinV/PI test. Expression of survivin was detected by reverse transcriptase PCR and Western blot. Results  ① 5Fu inhibited the JAR cell growth in a doseand timedependent manner. ② 5Fu caused the apoptosis of JAR cell in a concentrationdependent manner. ③ Survivin gene and protein decreased with the increase of 5Fu. Conclusion  The decrease of the expression of survivin may play a critical role in JAR cell apoptosis induced by 5Fu.　　KEY WORDS: 5Fluorouracil (5Fu); choriocarcinoma cell JAR; apoptosis; survivin　　Survivin是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)的新成员，在几乎所有常见肿瘤中都有过量表达[13]，且能明显抑制细胞凋亡的产生[4]，在绒癌的发生、发展中起重要作用。5氟尿嘧啶(5Fluorouracil, 5Fu)是临床上最常见治疗绒癌的化疗药物，它可以抑制肿瘤细胞生长，但其是否影响肿瘤细胞凋亡及其凋亡机制的报道较少见。我们通过本实验观察了5Fu对JAR细胞株的体外抑制作用及诱导凋亡作用，同时检测了5Fu作用JAR细胞后胞浆中survivin的表达情况，探讨了survivin在其诱导凋亡的过程中可能的作用机制。　　1  材料与方法　　1.1  材料  人绒癌细胞株(JAR)购自中科院上海细胞库；DMEM培养基、Trizol购自Gibco公司；胎牛血清购自四季青生物公司；5Fu购自美国Sigma公司；流式Annexin V/PI双染试剂盒购自深圳晶美生物制剂有限公司；PCR mix和逆转录试剂盒购自Fermantas MBI公司；survivin鼠抗人单克隆抗体购自美国Santa Cruz生物技术有限公司。　　1.2  方法　　1.2.1  细胞培养  JAR细胞株用含有10%(体积分数)胎牛血清的DMEM高糖培养基，在37℃、5%(体积分数)CO2中培养。细胞贴壁生长，胰酶和EDTA消化传代。　　1.2.2  噻唑蓝比色分析实验  5Fu组为25、50、100μg/L共三个不同剂量组，用培养液稀释，JAR细胞消化成单细胞悬液，用含10%(体积分数)胎牛血清的DMEM培养基调整细胞浓度为108/L，取上述细胞液100μL置96孔培养板中预培养24h。每组设6个复孔(实验重复6次)，接种后24h更换培养液。实验组加入不同浓度药物的培养液，阴性对照不加药，空白对照只加培养液，加药后于24、48、72h加入5mg/L的20μL MTT，同样条件下继续培养4h后倒出培养液，加入150μL二甲基亚砜(DMSO)振荡溶解10min，空白对照调零，酶联仪检测波长为490nm时各孔的吸光值(A值)，计算抑制率。抑制率=(阴性对照A490值-实验组A490值)/阴性对照A490值×100%。

　1.2.3  应用双标记流式细胞术定量分析凋亡情况  按照常规消化收集细胞(每个浓度三瓶)，以冰PBS洗两遍后，用试剂盒提供的结合缓冲液250μL重悬细胞，调整细胞浓度约为106/L，取100μL细胞悬液，各加入5μL Annexin VFITC和10μL PI，混匀，将试管避光放置15min，反应管中加400μL PBS，立即上流式细胞仪检测。结果判定：FITC-/PI-为活细胞，FITC+/PI-为凋亡细胞，FITC+/PI+为坏死细胞。　　1.2.4  逆转录聚合酶链反应检测survivin基因的表达  按照常规步骤消化并收集细胞，使细胞数达106-107/L，1000r/min离心10min，PBS洗2遍后，吸干PBS，加入1mLTrizol溶液裂解。按Trizol试剂说明提取细胞内的总RNA。按照逆转录试剂盒说明将总RNA转录成cDNA。之后按PCR mix试剂盒说明进行PCR扩增(PCR扩增仪为北京六一仪器厂制造)。RTPCR扩增survivin引物为5′CCCTGGCTCCTCTACTGT3′(正义)，5′CAAATCCATCATCTTACGC3′(反义)，扩增片段大小为466bp。βactin引物为5′GTGGACATCCGCAAAGAC3′(正义)，5′AAAGGGTGTAACGCAACTAA3′(反义)，扩增片段大小为302bp。反应条件：94℃变性1min，49.4℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸7min，扩增产物经2%(体积分数)琼脂糖凝胶电泳检测目的片段。BandScan分析软件分析。

　　1.2.5  免疫印迹检测survivin蛋白的表达  蛋白质提取：冰PBS洗细胞3次，吸净PBS，加入Triple裂解缓冲液200μL，将裂解物转移至离心管，混匀后离心，将上清液吸出，留待蛋白定量和实验。SDSPAGE电泳和免疫印迹：采用Bradford法测定蛋白质浓度，以30μg/孔上样，在15%(体积分数)的SDSPAGE凝胶中进行电泳分离，电转移法25V 12h将蛋白从SDSPAGE凝胶转移至醋酸纤维素膜，在含0.5g/L脱脂奶粉的TBST中37℃封闭1h，加入一抗(鼠抗人survivin单克隆抗体，稀释度为1∶100)，4℃孵育过夜，TBST充分漂洗(3min×6次)，加入二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，稀释度为1∶2000)，37℃作用1h，TBST充分漂洗(3min×6次)，DAB显色，观察结果。数据分析采用凝胶成像系统。

　　1.2.6  统计学处理  实验数据应用SPSS 13.0 for windows统计软件进行处理，采取重复测量设计资料的方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  5Fu对细胞生长的抑制作用  随浓度增加及作用时间延长，5Fu对JAR细胞生长的抑制作用增强。由此可见，5Fu对JAR细胞具有明显的抑制作用。相同条件下，24、48及72h均可观察到抑制率随药物浓度增加而提高(P<0.05)，并且相同药物浓度时，作用时间越长，抑制率越高(P<0.05，表1)。

　　表1  不同浓度5Fu在不同时间作用点对JAR细胞生长抑制率的影响（略）

　　Table 1  Effect of various concentrations of 5Fu on inhibition rate of JAR at different time points

　　*P<0.05 vs. 24h group, #P<0.05 vs. 48h group

　　2.2  5Fu对细胞凋亡的影响  作用24h后观察结果显示，5Fu诱导的细胞凋亡率与其浓度呈正相关，即凋亡率随着浓度增加而提高，25、50、100μg/L的5Fu作用后凋亡率分别为(13.86±1.36)%，(23.16±2.49)%，(57.37±5.10)%，各药物组与细胞对照组间有显著性差异(P<0.05)，各组间比较也均有显著性差异(P<0.05，表2)。

　　2.3  不同浓度的5Fu作用后survivin mRNA的表达  Survivin mRNA在JAR细胞中存在表达。RTPCR结果显示5Fu诱导JAR细胞凋亡时，survivin mRNA的表达受抑制而减少，作用24h观察，其表达随着浓度增加而减少。Survivin mRNA/βactin：25、50、100μg/L的5Fu作用后分别为0.436±0.049，0.428±0.044，0.297±0.022，各药物组与细胞对照组比较均有显著性差异(P<0.05)，25μg/L与50μg/L组间比较差异不显著(P=1.0)，其余各药物组间比较均有显著性差异(P<0.05，表2、图1)。

　表2  不同浓度5Fu作用24h后survivin mRNA/βactin, survivin/GAPDH以及apoptosis rate值的比较（略）

　　Table 2  The comparison of survivin mRNA/βactin, survivin/ GAPDH and apoptosis rate after 24h with different concentrations of 5Fu

　　*P<0.05 vs. 0 group,#P<0.05 vs. 25μg/L group, △P<0.05 vs. 50μg/L

　　图1  不同浓度的5Fu作用24h后survivin mRNA的表达（略）

　　Fig.1 The expression of survivin mRNA after 24h with different concentrations of 5Fu

　　2.4  不同浓度的5Fu作用后survivin蛋白的表达

　　Survivin蛋白表达于JAR细胞中，且其表达受到5Fu的抑制，24h后观察到其表达随药物浓度增加而减少。25、50、100μg/L的5Fu作用后其survivn/GAPDH值分别为：0.452±0.154，0.392±0.069，0.093±0.007，各药物组与细胞对照组比较均有显著性差异(P<0.05)， 25μg/L与50μg/L组间比较差异不显著(P=1.0)，其余各药物组间比较均有显著性差异(P<0.05，表2、图2)。

　　图2  不同浓度的5Fu作用24h后survivin蛋白的表达（略）

　　Fig.2 The expression of survivin protein after 24h with different concentrations of 5Fu

　　3  讨论    　　绒癌的发生一方面是由于细胞增殖紊乱，另一方面是细胞凋亡的不足。凋亡抑制蛋白(IAPs)在细胞凋亡的调控中发挥重要作用。Survivin是1997年发现的一个新成员，它特异地表达于多数人类肿瘤组织中，其主要作用为抑制肿瘤细胞凋亡和促进细胞增殖[5]，是迄今发现的最强的凋亡抑制基因。Survivin抑制凋亡的机制主要是通过特异结合于caspase，抑制其活化，从而阻断凋亡信号的传导[6]。因而，survivin已经成为肿瘤靶向治疗的一个新靶点[710]。    　　5Fu作为绒癌化疗的一线药物，目前已知5Fu通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，从而阻断尿嘧啶脱氧核苷转变为胸腺嘧啶脱氧核苷而影响DNA与RNA的合成，主要影响细胞增殖S期[11]，是一种抗代谢药。但是，5Fu诱导凋亡的机制仍未见阐明。本实验研究证实5Fu对JAR有明显的抑制增殖和诱导凋亡的作用。5Fu作用于JAR细胞后，显示survivin mRNA和蛋白表达水平成浓度依赖性降低，提示5Fu可能是通过抑制survivin转录和翻译，降低其mRNA和蛋白表达水平，从而诱导JAR细胞发生凋亡。    　　综上所述，5Fu对JAR有抑制增殖和诱导凋亡的作用，其凋亡的机制可能与下调survivin的表达有关，确切机制尚不清楚，有待于进一步研究。

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