新城疫病毒HN基因及其构建的核酸疫苗抗肿瘤作用研究进展

　　作者：蒋丽娜 综述 翟登高 审校 作者单位：河北北方学院医学技术学院免疫教研室，河北 张家口 075000)

　　【关键词】 病毒HN基因 核酸疫苗抗肿瘤

　　肿瘤的发生与发展是一个多因素、多阶段、多基因的复杂变化过程。传统的肿瘤手术治疗只能去除原发病灶,不能从根本上杜绝其再生与繁殖;放化疗虽能杀灭肿瘤细胞,但也使大量正常组织细胞受到严重损伤。随着核酸疫苗的发展,特别是治疗性疫苗的研制,为控制肿瘤提供了新的思路。NDV用于肿瘤治疗及在分子生物学水平上进一步研究 NDV的抑瘤机理引起了越来越多学者的关注。目前,应用NDV的HN基因构建核酸疫苗抗肿瘤治疗成为基因治疗肿瘤领域内研究的热点。本文就HN基因在NDV抗肿瘤上的作用，以及HN基因构建的核酸疫苗抗肿瘤作用机制的国内外的相关性研究情况进行综述。

　　1 新城疫病毒及其HN基因概况

　　新城疫病毒(newcastle disease virus，NDV)属副黏病毒科副黏病毒属成员。NDV一般呈球形，直径100～500nm，基因组为负链单股RNA，基因组约由15156个核苷酸组成，分子量(MW)约为5.5×106，为单一开放阅读框架，至少编码六种病毒特异性的蛋白(L、NP、P、HN、F、M)，1986年，P.Chambers等应用分子克隆技术建立了NDV的cDNA文库，结合限制性酶切图谱分析、斑点杂交、Northern Blot分子杂交等手段，确定了几个结构蛋白在基因组上是按3′-NP-P-M-F-HN-L-5′的顺序排列[1]。HN蛋白是NDV的主要免疫分子，其基因编码一相对分子质量为7.4×104的糖蛋白,表达在病毒包膜上,具有凝集红细胞及神经氨酸酶的活性,在病毒侵染过程中识别细胞受体、介导病毒吸附细胞膜。HN蛋白是NDV抗肿瘤的功能性蛋白,所具有类似于流感病毒的神经氨酸酶活性,可以水解细胞表面唾液酸,使肿瘤细胞细胞表面抗原充分暴露,增强肿瘤细胞的免疫原性,增强免疫监视细胞的识别和杀伤[2，3]。

　　2 HN基因构建的核酸疫苗抗肿瘤作用研究进展

　　NDV的HN蛋白在抗肿瘤作用中发挥着重要作用，国外和国内学者借助分子生物学和基因工程技术 在体外克隆表达HN蛋白，充分探讨其作用机制和效果。国外的研究表明[3],HN蛋白不仅介导病毒吸附于肿瘤细胞并与融合蛋白一起帮助病毒侵入肿瘤细胞,其神经氨酸酶活性,能水解宿主细胞表面唾液酸,暴露宿主细胞生物识别位点,诱导外周血单核淋巴细胞表面表达TRAIL(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL)并不依赖该病毒的复制。国内的研究将新城疫病毒血凝素神经氨酸酶(HN)基因以核酸疫苗的形式进行多方面研究，魏林等[4,5]采用RT-PCR 从NDV中克隆HN cDNA,并构建HN的真核表达载体pcDNA3-HN，通过转染COS-7细胞,其质粒能良好地表达,并具有与鸡红细胞发生凝集的生物学特性。并将该质粒应用于C57荷瘤小鼠,实验表明其在一定程度上能够抑制肿瘤的生长。pcDNA2-HN治疗组荷瘤小鼠脾细胞的NK及CTL活性比未治疗组有明显的升高,说明此质粒具有增强荷瘤小鼠非特异及特异性抗肿瘤细胞免疫的作用。米志强[6]以pVAX1为表达载体构建了含NDV HN基因的pVHN核酸疫苗，进行体内外的抗肿瘤研究实验。结果表明，单独HN基因在体外转染能够降低肿瘤细胞表面唾液酸含量，体内表达后引起T淋巴细胞亚群数量改变，能够抑制实体瘤的成长。含有HN基因的重组质粒对人肿瘤细胞具有杀伤作用,可诱导肿瘤细胞凋亡,薛立娟等[7]以pIRElneo为表达载体构建了NDV HN基因的pIRHN核酸疫苗，在体外转染Hela细胞，检测pIRHN在真核细胞当中的表达状况和HN基因导致细胞死亡的类型，同时测定Hela细胞唾液酸含量的变化。pIRHN能够在真核细胞中表达，能促进肿瘤细胞死亡，其死亡方式主要以诱导细胞凋亡为主，可能通过其表达产物与肿瘤细胞唾液酸受体的相互作用，发挥其抗肿瘤作用。

　　近年来，人们在采用一个载体携带HN基因治疗肿瘤研究基础上，越来越关注联合基因治疗的研究，以探讨更好的治疗肿瘤的方法。王秀荣等[8]采用MTT法和乳酸脱氢酶释放法，检测IL-15质粒、PCD-HN质粒对小鼠抗肿瘤免疫反应作用中T淋巴细胞的增殖和NK细胞的活性。IL-15质粒、PCD-HN质粒同时免疫小鼠，其淋巴细胞增殖指数和自然杀伤细胞活性的百分率明显高于其它实验组，说明两者对抑制肿瘤生长具有迭加效应。李宵[9]等构建了表达融合IL-18HN和VP3IL-18的真核表达质粒,将该重组质粒与单独表达IL-18HN和凋亡素基因的重组质粒分别注射荷B16肿瘤C57BL/6小鼠,通过比较抑瘤率,探讨了HN、凋亡素和IL-18基因的协同抑瘤效果。结果显示,pIRVP3IL-18HN重组质粒的抑瘤效果明显高于上述基因的单独应用,说明凋亡素基因与 IL-18和HN有协同抑瘤效应,联合基因治疗可显著提高抑瘤效果。连海[10]等构建了含 HN基因和VP3基因的真核重组子pVHN和pVVP3,应用HN基因和VP3基因联合治疗荷S180肿瘤BALB/c鼠以及荷B16肿瘤C57BL/6鼠,结果表明其抑瘤作用显著,且联合治疗的效果明显好于单纯的HN组或VP3组。

　　另外,HN蛋白定位于肿瘤细胞膜上形成自身特殊的识别部位也提高了机体免疫系统对肿瘤细胞的识别杀伤。新城疫病毒的HN 蛋白具有神经氨酸酶活性能水解宿主细胞表面唾液酸,暴露宿主细胞生物识别位点并上调MHCI分子的表达,且HN蛋白定位于肿瘤细胞膜上形成自身特殊的识别部位从而提高了机体免疫系统对肿瘤细胞的识别杀伤[11]。连海[10]等所研究的实验分别测定了对照组与治疗组裸鼠血清唾液酸含量,表明HN基因在体内发挥了神经氨酸酶的作用,显著降低了血清中唾液酸的含量。

　　自从20世纪50年代Caslary发现新城疫病毒使农场主晚期胃癌的转移受到抑制以来，NDV的抗肿瘤作用一直被人们所重视并将其应用于临床[12]。研究发现NDV在体内能够抑制人的黑色素瘤、淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌、膀胱癌、肺癌和肾癌等恶性肿瘤[13~16]。 目前国外对NDV抗肿瘤作用的研究主要集中在该病毒体内应用后的佐剂作用上，瘤内注射NDV能诱导产生多种细胞因子，诱导淋巴细胞浸润，促进T细胞毒性反应并加强NK细胞杀伤肿瘤细胞的效应，NDV能够特异性感染肿瘤细胞并在肿瘤细胞表面表达病毒蛋白增强肿瘤细胞的抗原性从而加强杀伤细胞对肿瘤细胞的清除。国内的学者主要对人体外培养细胞进行研究，体内主要是动物实验。连海[17]等构建的 HN 基因真核重组质粒,经脂质体介导的方法导入人肺癌细胞SPC-A1,并通过荧光染色结合流式细胞仪分析等方法研究其体外对肺癌细胞的作用方式并探讨其机制，阐明了新城疫病毒 HN基因诱导人肺癌细胞SPC-A1凋亡与细胞内线粒体途径的关系。HN基因进入SPC-A1细胞后可能首先作用于线粒体,引起细胞线粒体通透性的改变,线粒体内氧化呼吸链受抑,ROS外漏,可见ΔΨm下降,ROS水平升高.另外,ROS增加可使线粒体释放Cyt c,进而活化caspases-3,最终诱导SPC-A1肿瘤细胞凋亡.这些结果将为新城疫病毒 HN 基因开发成用于临床上抗肺癌的生物制剂奠定基础。

　　新城疫病毒免疫治疗肿瘤已经发展到用病毒来修饰自体肿瘤细胞以制备自体肿瘤细胞疫苗对病人进行主动特异性免疫治疗。国外，Batliwalla FM等[18]用NDV作为肿瘤溶解剂来治疗AJCC Ⅲ期的恶性黑素瘤患者，通过对免疫学的效果和外周血T细胞的计数发现这些患者身体状况改善，存活期明显增长。国内，吴淼[19]等采用新城鸡瘟病毒修饰的自体肿瘤疫苗(NDV-ATV)治疗胃癌术后患者，能明显改善胃癌患者术后机体的免疫功能,提高机体抗肿瘤能力。巩平等[20]以消化道肿瘤患者术后自体肿瘤细胞为靶细胞,用具有多组织亲和性的新城鸡瘟病毒(NDV)为基因载体,经生物免疫技术处理后,制成NDV修饰的自体肿瘤细胞疫苗(NDV-ATV),再免疫接种于术后肿瘤患者。通过检测38 例消化道肿瘤患者术后NDV-ATV联合化疗前后及22例消化道肿瘤患者术后单纯化疗前后淋巴细胞亚群、NK细胞及免疫球蛋白水平的变化,探讨NDV-ATV联合化疗对消化道肿瘤患者术后免疫功能的影响;NDV-ATV主动免疫对细胞免疫的调节作用非常明显。

　　目前，我国每年死于癌症肿瘤的人数为140～150万，在这方面每年花费约140亿，迫切需要寻找一种科学、有效、无毒副作用、成本少的治疗方法。因此，研究NDV HN基因为开发成用于临床上抗肿瘤的生物制剂以及深入研究HN基因的抗肿瘤机制具有重要意义。

　　【参考文献】

　　1 Chambers P,Nesbit M,Yusoff K,et al.Location of a neutralizing epitope for the haemagglutin in-nerraminidase glycoprotein of newcastle disease virus[J].J Gen Virol,1998,69:2115-2122

　　2 Danen-Van Oorschot AA,van der Eb AJ,Noteborn MH,et al.BCL-2 stimulates Apoptin-induced apoptosis[J].Adv Exp Med Biol,1999,457:245-249

　　3 Zeng J,Fournier P,Schirrmacher V. Induction of interferon alpha and tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand in human blood mononuclear cells by hemagglutinin neuraminidase but not F protein of Newcastle disease virus[J]. Virology,2002,297:19-30

　　4 魏林，戴建新，孙树汉.新城疫病毒HN基因真核表达质粒的构建及其抗肿瘤作用的初步研究[J].第二军医大学学报，2000，21(6)：515-518

　　5 魏林，戴建新，傅传刚. 新城疫病毒HN基因对肿瘤抗原诱导的抗肿瘤免疫的增强作用[J].中华微生物学和免疫学杂志，2001，21(6)：619-622

　　6 米志强，金宁一，龚伟. pVVP3和pVHN核酸疫苗的构建、表达及对肿瘤细胞的作用[J].中国生物化学与分子生物学报，2003，19(6)：704-706

　　7 薛立娟，龚伟，葛涛,等. 新城疫病毒plRHN核酸疫苗构建和表达及对肿瘤细胞的影响[J]. 中国免疫学杂志，2002，18(5)：338-340

　　8 王秀荣，王秀英，冯惠东. 白细胞介素-15协同新城疫病毒HN基因抗肿瘤免疫的作用[J]. 四川大学学报，2005，36(2)：284-285

　　9 李宵,金宁一,米志强,等,联合应用凋亡素基因、新城疫病毒HN基因及IL-18基因对黑色素瘤的抑制效应研究[J].高技术通讯,2004,12(1):33-35

　　10连海，金宁一，米志强,等，新城疫病毒HN基因与鸡贫血病毒VP3基因对裸鼠荷HCT肿瘤的治疗[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2003,10(2):88-92

　　11Zeng J,Fournier P,Schirrmacher V. Stimulation of human natural interferon alpha response via paramyxovirus hemagglutinin lectin-cell interaction[J].Mol Med,2002,80(7):443

　　12Csalary LK，Moss RW,Beuth J,et al.Benneficial treatment of patients with advanced cancer using a newcastle disease virus vaccine(MTH-68/H)[J].Anticancer Res,1999,19:635-638

　　13Schirrmacher V,Griesbach A,Ahlert T,et al.Antitumor effects of newcastle disease virus in vivo:local versus systemic effects[J].Int J Oncol,2001,18:945-952

　　14Kaminska T,Dmoszynska A,Hus I,et al.Effects of granulocyte colony stimulating factor treatment on exvivo cytokine production by blood cells of patients after chemotherapy or radiotherapy[J].Arch Immumol Ther Exp,1999,47:61-65

　　15Phuangsab A,Lorence RM,Reichard KW,et al.Newcastle disease virus therapy of human tumor xenografts:antitumor effects of local or systemic administration[J].Cancer Lett,2001,172:27-36

　　16Zorn U,Duensing S,Langkopf F,et al.Active specific immunotherapy of renal cell carcinoma:cellular and humoral immune responses[J].Cancer Biother Radio,1997,12:157-168

　　17连海，金宁一，李宵,等，新城疫病毒HN基因诱导人肺癌细胞SPC-A1凋亡的作用机制[J].中国生物化学与分子生物学报，2006，22(3):222-227

　　18Batliwalla FM，Bateman BA，Serrano D，et al.15-year follow-up of AJCC stage Ⅲ malignant melanoma patients treated postsurgically with newcastle disease virus(NDV)on colysate and determination of alterations in the CD8 T cell repertoire[J].Mol Med，1998，4(12)：783-794

　　19吴淼，余佩武，曾冬竹,等，胃癌患者术后 NDV-ATV 治疗对机体免疫功能的影响[J].实用癌症杂志,2003，18(2)：179-181

　　20巩平，李永祥，王仙,等，NDV-ATV 联合化疗对消化道肿瘤患者免疫功能的影响[J].农垦医学，2006，28(4)242-243