iNOS和HIF1α在骨肉瘤中的表达及其临床病理相关性研究

　　作者：耿艳华 王昌兴 陈培辉 作者单位：310009 浙江大学医学院附属二院 310005 浙江省新华医院

　　【摘要】 目的 从酶蛋白水平研究骨肉瘤组织缺氧代谢过程中iNOS、HIF1α的表达及与临床、病理特征的关系;探讨它们在肿瘤发展过程中作用的可能机制。方法 筛选不含硬骨组织，未经脱钙处理的骨肉瘤标本59例，依据临床病理特征进行分组，并行术后随访。应用免疫组织化学EnVision法检测肿瘤组织中iNOS、HIF1α表达，应用χ2检验、Spearman等级相关分析等进行统计分析。结果 骨肉瘤中iNOS、HIF1α表达阳性率分别为 86.44%、38.98%，对照组中分别为 9.9%和0，两组比较，差异均有显著性。HIF1α的表达与骨肉瘤患者年龄有关(P<0.01)，iNOS则无关(P>0.05)。HIF1α和iNOS的表达均与骨肉瘤组织学类型有关， iNOS、HIF1α在髓内高分化型和骨旁型骨肉瘤总阳性表达率分别为33.33%和0，分别低于其余各组总和阳性率91.30%和41.30%，差异有显著性(P<0.01和0.05)。HIF1α与iNOS表达正相关，两者共阳率38.98%，共阴率13.56%。iNOS阳性与阴性组中，HIF1α的阳性表达率分别为45.10%和0，差异有显著性(P<0.01)。结论 iNOS与HIF1α在骨肉瘤组织中均高表达，与肿瘤的发生、发展有关，可能协同促进肿瘤的恶性进展。

　　【关键词】 骨肉瘤 诱导型一氧化氮合酶 缺氧诱导因子1α 免疫组织化学

　　【Abstract】 Objective To investigate the expressions of HIF1α and iNOS in 59 cases of osteosarcoma and their correlations with clinical and pathological features, and to explore their roles in tumor development . Methods 59 cases typical osteosarcoma specimens without os osseum tissue and non-decalcification were obtained and grouped according to the clinicopathologic characteristics, the followed-up data of postoperative patients were collected. The tests were examined by immunohistochemical staining (EnVision). Data were evaluated by χ2 and Spearman rank correlation analysis. the survival data of postoperative were performed by kaplan-meier survival curve analysis and Log-Rank method. Results The positive expression rates of iNOS and HIF1α in osteosarcoma were 86.44% and 38.98% respectively , which were significantly higher than that of control group (P<0.01 and 0.05), respectively. The expression of HIF1α was positively related with the age (P<0.01),but the iNOS was not (P>0.05). The expression of HIF1α and iNOS were positively related with the histological classifications, in iNOS and HIF1α positive groups, total positive rates of intraosseous well-differentiated and parostea osteosarcoma was 33.33% and 0, respectively, which was remarkably lower than that of the other groups (91.30% and 41.30%,) with significant difference (P<0.01 and 0.05, respectively). Among the samples ,HIF-lαand iNOS both expressed in 38.98%, no expression of either of them in 13.56%, the positive expression rate of HIF-lα in the group of positive and negative iNOS were 45.10% and 0, respectively, which showed a compacted positive correlation between them (P<0.01). Expressions of HIF1αdemonstrated negative correlation with the postoperative survival time(P<0.01), but the iNOS didn't (P>0.05). Conclusions iNOS and HIF1α are expressed in osteosarcoma tissue . They play a cooperative role in influencing the growth of tumor. The expression of HIF1α may be a useful prognostic index of osteosarcoma.

　　【Key Words】 osteosarcoma induciblenitricoxidesynthase hypoxia-induciblefactor-1α immunohistochemistry

　　肿瘤的发生、发展过程中常显示多方面与肿瘤恶性行为有关的基因表达异常。好发于青少年，具有较高恶性度的骨肉瘤，因其增殖活跃、快速耗氧和自身血管状态、功能异常产生不同程度的缺氧，病理条件下肿瘤细胞通过自身的调节变化来适应和改善缺氧，促进生长。研究证实肿瘤的缺氧状态可通过诱导缺氧诱导因子1α(Hypoxia -Inducible factor-1 alpha，HIF1α)的表达来调控并维持氧和代谢的稳定，促进自身生长和转移。而诱导型一氧化氮合酶 (Inducible nitric oxide synthase，iNOS)——重要的信号分子(NO)诱导酶在肿瘤缺氧状态下也可被诱导表达，研究表明HIF1α表达与iNOS在子宫内膜、肺、胃、结肠、胰腺、乳腺及膀胱癌等多种上皮性肿瘤中显示相关，影响肿瘤的生长，而间叶肿瘤，特别在骨肉瘤中情况如何，与肿瘤恶性行为的关系尚不清楚。本研究将初步探讨这些问题。

　　1 资料和方法

　　1.1 一般资料

　　筛选本科2002至2006年间不含硬骨组织，未经脱钙处理的骨肉瘤确诊标本59例，其中男20例，女39例;年龄7～56岁，平均19.3岁，中位17.2岁。临床分布：原发51例、复发伴肺转移1例、转移7例;组织学分级：高分化6例、低分化53例;组织学：普通型36例、血管扩张型、骨旁型各5例、表面高密度恶性型3例、髓内高分化型、圆细胞型、骨膜骨肉瘤各1例;临床分期：Ⅰ期35例、Ⅱ期16例、Ⅲ期8例。随访时间5～48个月，平均20.1个月。取骨纤维结构不良11例做阴性对照。

　　1.2 方法

　　采用免疫组织化学(ultra sensitive EnvisionTM)二步法进行。用已知阳性切片作阳性对照。免疫组化染色iNOS、HIF1α均以肿瘤细胞胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞;根据肿瘤细胞阳性比例和着色强度综合制定免疫组化半定量标准[12]，阳性细胞记分：<1%, 0分;1%～10%, 1分;11%～50%, 2分;51%～80%, 3分;>80%, 4分;着色强度记分：弱，1分;中，2分;强，3分。两分值相加最终判定结果：1分(-);2～3分(+);4～5分(++);6～7分(+++)。用χ2检验，Spearman等级相关分析评价iNOS、HIF1α表达的意义、表达相关性及与临床、病理特征的关系。所有数据用SPSS 13.0分析软件处理，显著性水平α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 骨肉瘤组织中iNOS、HIF1α的表达

　　瘤组织中iNOS表达阳性51例(86.44%)，对照组阳性1例(9.09%)，两组比较，差异有极显著性(χ2=25.13，P<0.01);HIF1α表达阳性23例(38.98%)，对照组均阴性，两组比较，差异有显著性(χ2=4.74，0.01

　　2.2 iNOS、HIF1α表达与骨肉瘤临床病理特征的关系

　　iNOS的表达与年龄、临床分期、转移均无关(χ2分别= 0.95、0.34、0.42，P值均>0.05);HIF1α的表达与年龄有关(χ2分别=8.61，P值<0.01)，而与临床分期、转移无关(χ2分别= 0.54、0.09，P值均>0.05)。表1 iNOS、HIF1α表达与骨肉瘤组织临床病理特征的关系(略)

　　2.3 iNOS、 HIF1α表达与骨肉瘤组织学类型的关系

　　二者表达均与骨肉瘤组织学类型有关，在HIF1α阳性表达组中，血管扩张型、高度恶性浅表型和普通型总和阳性表达率为41.30% (19/46)，而其余组总和阳性表达率为0，差异显著(χ2=3.91,P<0.05)。iNOS阳性表达组中，骨内高分化型和骨旁型总阳性表达率为33.33%(2/6)，显著低于其余各组总和阳性表达率91.30%(42/46)，差异有显著性(χ2=13.70，P<0.01)。结果见表1。

　　2.4 骨肉瘤组织中HIF1α、iNOS表达的相关性

　　HIF1α和iNOS均阳性表达者23例，均阴性者8例，iNOS阳性、HIF1α阴性者28例，iNOS阴性、HIF阳性者0例,iNOS阳性表达组中，HIF1α的阳性表达率为45.10%(23/51);在iNOS阴性表达组中，HIF1α阳性表达率为0，差异有显著性(χ2=26.04, r=0.460;P<0.01)，两者表达呈正相关。

　　3 讨论

　　3.1 iNOS表达与骨肉瘤的关系

　　iNOS主要是在病理情况下诱导生成,催化产生NO参与血管生成、肿瘤的发展和转移等过程。检测iNOS的表达可间接推测NO的生成。目前认为，NO的作用机制存在双重性，主要取决于NO的浓度，一方面，高浓度的NO可通过阻止肿瘤细胞中线粒体的氧化和DNA的合成发挥抗肿瘤效应;另一方面，更多研究认为中、低浓度的NO有助于肿瘤的进展与转移，NO在超氧阴离子存在的情况下转化为强毒性的过氧亚硝酸盐，引起DNA破坏，因而具有潜在的致癌性[1]。本研究发现，iNOS在骨肉瘤组织中的表达增高，并随病理分级和临床分期的增高而增加，且与组织学分型密切相关。本研究中，恶性度高类型骨肉瘤中iNOS高表达可能与肿瘤的高增殖、高侵袭有关，可能是肿瘤抵抗缺氧的反应，而iNOS催化生成的肿瘤微环境中的NO，又有利于肿瘤的发展，其机理可能是NO及其产物引起肿瘤组织血流或血管通透性增加，并促进肿瘤新生血管的形成[2]，同时NO亦可通过刺激肿瘤细胞的侵袭性，诱导血管生成和调节免疫系统来促进肿瘤的生长、侵袭和转移[3]。因此iNOS高表达在骨肉瘤发生、发展中起重要作用。

　　3.2 HIF1α表达与骨肉瘤的关系

　　缺氧诱导因子1(HIF1)是细胞缺氧反应的中心调控因子，控制着关键的缺氧反应基因(HRG)的表达，使细胞适应不同的氧浓度[4]，维持氧和代谢的稳定，实验证实与这些适应性反应一致的是缺氧能够明显影响细胞的增殖和凋亡[5]、并与远处转移、侵袭性增加和生存率下降密切相关[6]，有研究证实HIF1α可通过调节VEGF的表达在骨肉瘤血管生成中发挥着重要作用[7]，本研究中HIF-1α在骨肉瘤中的表达明显高于对照组，表达与患者的年龄和组织学分型显著相关，年龄小，组织学类型恶性度高者，HIF-1α表达高，而年龄小，机体免疫力较低，年龄的大小又与肿瘤的病理类型有一定关系，随着年龄增加，骨肉瘤恶性程度降低。恶性度高，细胞则增殖快，能耗高，侵袭力强可见HIF1α表达与其调节骨肉瘤细胞适应及改善缺氧微环境及与肉瘤细胞的浸润和转移关系密切。

　　3.3 骨肉瘤中iNOS与HIF1α表达的关系

　　本研究显示HIF-1α与iNOS在骨肉瘤组织中的表达呈正相关，表明它们在骨肉瘤的发生中可能是很重要的相关因素，HIF-1α可能诱导iNOS蛋白表达，协同促进肿瘤生长。研究证实肿瘤内部的微环境中，缺氧诱导HIF-1α和iNOS表达增加，而iNOS催化生成NO。对缺氧性肺动脉高压大鼠的研究表明HIF-1α和iNOS均参与发病过程，HIF-1α对iNOS可能具有转录激活作用，而iNOS对HIF-1α的表达可能具有抑制作用，实验发现，缺氧初期两者表达均增高，但伴随缺氧时间的加长，肺动脉平滑肌iNOSmRNA和蛋白质持续高表达，而HIF-1α表达逐渐下降，两者表达水平与HIF-1α蛋白质表达水平呈负相关，提示iNOS对HIF-1α蛋白质的表达水平可能具有负向调节作用。而本研究显示骨肉瘤组织存在一定程度的HIF-1α蛋白过表达，但并不象iNOS那样高水平，这是否也存在肿瘤发展到一定阶段iNOS对HIF-1α表达水平的负向调节起作用了呢?而那些HIF-1α不表达的病例恰恰是那些临床病理学指标稍好的病例，这个结果是可以用上述结论来解释的，故作者推测肿瘤发展到一定阶段，而非缺氧初期，iNOS可能通过一氧化氮途径下调了HIF-1α的表达。这种机制是否与缺氧耐受或缺氧改善及负反馈机制的形成有关，有待进一步研究。

　　【参考文献】

　　1 Shochina M, Fellig Y, Sughayer M,et al. Nitric oxide synthese immunoreactivity in human bladder carcinoma. Mol Pathol, 2001, 54(4): 248～252.

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　　6 Gregg L, Semenza. HIF-1 and tumor progression: pathophysiology and therapeutics. Trends in Molecular Medicine, 2002, 8(suppl4):62～67.

　　7 王燕，丘锯世，乔慧，等. 骨肉瘤中HIF-1α、VEGF、P53表达与血管生成和预后的关系. 临床与实验病理杂志, J Clin Exp Pathol, 2004 20(2): 182～186.