胃癌PTEN、VEGF与微血管密度相关性及意义

　　作者：唐咏梅 黄明哲 胡茂通 朱献斐 费哲为 张一楚 作者单位：322000 浙江省义乌市中心医院(唐咏梅 胡茂通朱献斐)　200092 上海交通大学医学院附属新华医院(黄明哲费哲为 张一楚)

　　关键字:胃癌PTEN、VEGF与微血管密度相关性及意义

　　PTEN基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)，又名MMAC1/TEP1基因，为第1 0号染色体同源丢失性磷酸酶 -张力蛋白的抑癌基因[1]。而血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor， VEGF)能特异性刺激内皮细胞增殖，在血管新生中扮演重要角色[2]。二者与肿瘤浸润、转移及血管新生(angiogenesis) 有密切关系，在肿瘤的多步骤演进中起重要作用[3]。PTEN、VEGF基因表达与胃癌的关系，令人关注。

　　本研究采用超敏SP免疫组化法,检测胃癌组织的PTEN、VEGF表达与微血管密度(microvascular density，MVD)，结合临床病理学特征，以明确PTEN、VEGF表达与MVD的关系及其临床意义。

　　1 材料和方法

　　1.1 一般资料

　　收集本院2003年1月至2004年6月手术切除胃癌标本138例。其中男91例，女47例，年龄30～82岁，73例年龄超过60岁。按UICC标准，TNM分期Ⅰ、Ⅱ期80例，Ⅲ、Ⅳ期58例;淋巴结转移数≥1个95例;伴有血管浸润49例;术前未接受放疗和化疗。

　　1.2 方法

　　(1)取材制片:选取肿瘤细胞丰富，无坏死组织的石蜡标本，每一蜡块连续切取三张4μm厚切片。(2)染色步骤: 采用SP超敏浓缩试剂盒，临用前稀释100倍;组织切片经二甲苯脱蜡、酒精水化, 水浴中煮沸15min行抗原热修复;滴加适当稀释的第一抗体[PTEN(1:60)，VEGF (1:100)和CD34(1:60) 均为福州迈新产品],孵育60min;再滴加第二抗体,孵育15min，过氧化酶反应5min，以上反应均置于37℃培养箱。DAB 显色,苏木素复染,封片。

　　1.3 结果判断

　　在临床病理资料的双盲条件下，分别由二位经验丰富的病理医师，在肿瘤实质区选取8个视野，记数肿瘤细胞总数及阳性染色肿瘤细胞所占比例，独立判定结果，最后核实确认。PTEN阳性表达为细胞浆染色;VEGF阳性表达为肿瘤细胞核染色成棕褐色;将阳性表达肿瘤细胞百分比≤10%记为-;11～25%记为+;26～50%记为++;>50%记为+++。阳性细胞数>10%为结果阳性。

　　1.4 MVD测定

　　采用CD34抗体标记血管内皮细胞，低倍镜下选取肿瘤浸润区域微血管数量最密集的视野，再在200倍视野范围计算3个视野的微血管数目，取其平均值作为MVD[4]。肿瘤区域凡是染成棕色的单个内皮细胞或内皮细胞簇，均作为一个血管计数。

　　1.5 统计学处理

　　利用SPSS 12.0 for windows软件进行数据处理，数值以(x±s)表示,显著性比较采用t检验和χ2检验，P<0.05认为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 PTEN、VEGF的表达和MVD值

　　PTEN在正常胃腺上皮表达阳性，阳性表达部位为肿瘤细胞浆，其PTEN表达阳性率为42.7%(59/138)。VEGF在正常胃腺上皮表达阴性，阳性表达部位为肿瘤细胞浆，其VEGF表达阳性率为85.5%(118/138)。采用CD34标记微血管清晰，定位确切。仅计数肿瘤细胞浸润区域，其MVD值范围在26～85之间，平均为45.77。

　　2.2 PTEN、VEGF表达和MVD与胃癌临床病理特征的关系

　　PTEN表达阳性率在浸润深度超过肌层、淋巴结转移阳性、临床分期为ⅢⅣ期者，分别为35.4%(29/82)、36.8%(35/95)和29.3%(17/58)，与对照组比较，呈显著性意义的低表达(P<0.05或P<0.01);在138例胃癌中，根据其分化程度分为分化型(differentiatde)(包括中/高分化管状腺癌、乳头状腺癌、粘液腺癌)与其他型(others)(包括低分化腺癌、粘液细胞癌、未分化癌)两组。VEGF表达阳性率在组织类型分化型、淋巴结转移阳性、伴血管浸润者，分别为95.2%、90.5%和93.9%，与对照组比较，呈显著性的意义高表达(P<0.05)。以MVD中位数值为界，分为MVD低值组(MVD<42.5)和高值组(MVD>42.5)，发现在浸润深度超过肌层和淋巴结阳性组，其MVD高组比例分别达57.3%(47/82)、58.9%(56/95)，与对照组比较，存在显著性意义(P<0.05，P<0.01);而与年龄、性别、组织类型、血管浸润、临床分期等均无相关性(P>0.05)。

　　2.3 胃癌PTEN、VEGF表达与MVD的关系

　　PTEN表达与MVD之间具有非常显著性意义，PTEN表达阴性者MVD为48.52，显著高于PTEN表达阳性者的42.10，P<0.01;VEGF表达与MVD之间具有非常显著性，VEGF表达阳性者MVD为46.91，显著高于VEGF表达阴性者的39.10，P<0.01;见表2。表2 胃癌中PTEN、VEGF表达与MVD的相关性(略)注：**P<0.01

　　2.4 胃癌PTEN、VEGF表达的相关性

　　VEGF表达阳性率在PTEN阴性组为94.9%(75/79)，显著高于PTEN阳性组的72.9%(43/59)，P<0.01;等级相关分析结果为rs=-0.548, P<0.01，表明PTEN 和VEGF表达之间存在显著的负相关，见表3。表3 胃癌中PTEN、VEGF表达的关系(略)注：**P<0.01

　　3 讨论

　　PTEN是第一个具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因 ,与肿瘤浸润、转移及血管新生(angiogenesis)关系密切。PTEN在正常胃腺上皮表达阳性，胃癌肿瘤细胞其表达阳性率仅为42.7%，提示PTEN存在一定程度的失活现象。PTEN表达阳性率在浸润深度超过肌层、淋巴结有转移、临床分期为Ⅲ、Ⅳ期者，与对照组比较，呈显著性的低表达(P<0.05或P<0.01)。随着肿瘤的演进，PTEN表达呈下降趋势， 与Zheng HC等[5]的研究一致，PTEN表达与浸润深度、转移、生长类型、Lauren’s分型、组织学类型显著相关。进展期胃癌明显下调。

　　本研究胃癌VEGF表达阳性率达85.5%，VEGF 阳性表达与分化程度、淋巴结转移、血管浸润相关，与年龄、性别、浸润深度、临床分期等均无相关性。 VEGF高表达在分化型多见，可能与腺管上皮的局部蛋白集聚有关。而与淋巴结转移、血管浸润的相关性，强烈提示与转移能力的关系。文献中VEGF表达阳性率跨度很大，从26.7%～84.0%的阳性率，Kakeji等研究表明，VEGF阳性胃癌呈为较大体积、进展期等，其阳性组生存率低于阴性组，能独立预测肝转移。

　　肿瘤血管新生机制复杂，微血管计数法是检测评估血管新生的一种间接手段。Bialas等比较了FⅧ, CD31, CD34等内皮细胞标记物，研究结果以CD34为理想。本研究也同时比较了多种内皮细胞标记，采用CD34标记微血管清晰， 定位确切，使微血管计数简单高效。非肿瘤的炎症区域，有时有较高的微血管标记，计数时应该于以排除，仅计数肿瘤细胞浸润区域。本组MVD值范围在26-85之间，平均为45.77，文献MVD值大致在34-48之间，高MVD总生存率显著低下。本研究显示，高MVD组与浸润深度、淋巴结阳性相关，MVD的高低与性别、组织类型、血管浸润、临床分期等均无相关性(P>0.05)。

　　胃癌PTEN、VEGF表达与MVD之间具有显著性意义。PTEN表达阴性者MVD显著高于PTEN表达阳性者;而VEGF表达阳性者MVD显著高于VEGF表达阴性者。Zhou 等发现，PTEN失活与VEGF过表达有关，其失活与血管新生有关，PTEN的阴性表达伴随VEGF过表达现象，PTEN可能间接通过VEGF的促进血管新生作用，使MVD值增高。

　　PTEN表达与VEGF表达之间存在显著关联。VEGF表达阳性率在PTEN表达阴性组为94.9%(75/79)，显著高于PTEN表达阳性组的72.9%(43/59)，P<0.01;等级相关分析结果表明，PTEN 和VEGF表达之间存在显著的中度负相关。

　　本研究显示，PTEN 阴性表达与胃癌的浸润深度、淋巴结累犯和临床分期具有相关性，VEGF阳性表达与分化程度、淋巴结转移、血管浸润相关;MVD与浸润深度、淋巴结是否受累相关，提示PTEN失活和VEGF的激活在胃癌进程中共同发挥作用。联合检测PTEN、VEGF表达和MVD，对把握胃癌生物学行为和预后的判断等，具有一定的价值。

　　【参考文献】

　　1 Steck PA,Pershouse MA,Jasser SA,et al.Identification of a candidate tumour suppressor gene,MMAC1,at chromosome 10q23.3 that is mutated in multiple advanced cancers.Nat Genet，1997，15:356～362.

　　2 Robinson C, Stringer S: The Splice Variants of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) and Their Receptors. Journal of Cell Science，2000，114:853～865.

　　3 Tahara, E. "Genetic pathways of two types of gastric cancer." .IARC Sci.Publ. 2004;157: 327～349.

　　4 Weidner N, Folkman J, Pozza F,et al. Tumor angiogenesis: a new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma. J Natl Cancer Inst，1992， 84: 1875～1887.

　　5 Hua-Chuan Zheng,Yi-Ling Li,Jin-min Sun,et al. Growth,invasion, metastasis, differentiation, angiogenesis and apoptosis of gastric cancer regulated by expression_ of PTEN encoding products. World J Gastroenterol 2003;9(8):1662～1666.